溶菌酶及ε-聚赖氨酸抑菌活性响应面优化

时间：2021-04-29 20:06:55 来源：蒲公英阅读网 本文已影响人

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　摘

　要

　ε-聚赖氨酸及溶菌酶是一种微生物源的天然食品防腐剂。指示菌为大肠杆菌和枯草芽孢杆菌，采用平板计数法分析抑菌效果，考察 ε-聚赖氨酸及溶菌酶的抑菌效果，及响应面法优化 ε-聚赖氨酸及溶菌酶浓度、作用时间。结果表明：ε-聚赖氨酸及溶菌酶均能抑制 2 种指示菌，对大肠杆菌最优抑菌条件为：溶菌酶浓度0.10%，处理时间 120min，ε-聚赖氨酸浓度 0.14%，处理时间 45min。对枯草芽孢杆菌最优抑菌条件为：溶菌酶浓度 0.08%,处理时间 40min，ε-聚赖氨酸浓度0.06%，处理时间 180min。本研究可为 ε-聚赖氨酸及溶菌酶作为食品防腐剂在食品工业中的应用提供参考。

　关键词：

　食品防腐；ε-聚赖氨酸；溶菌酶；抑菌；响应面优化

　Abstract

　ε-polylysine and lysozyme are natural food preservatives derived from microorganisms.The bacteriostatic effects of ε-polylysine and lysozyme were analyzed by plate counting method, and the concentration and action time of ε-polylysine and lysozyme were optimized by response surface method.The results showed that ε-polylysine and lysozyme can inhibit indicator bacteria.Optimal formulation for E.coli ：

　lysozyme 0.10% ， 120min and ε-polylysine 0.14%,45min.Optimal formulation for Bacillus subtilis:lysozyme 0.08%，40min and ε-polylysine 0.06%,180min.This study provides a reference for ε-polylysine and lysozyme as food preservatives in food industry.

　Key words: food preservation; ε-polylysine; lysozyme; antimicrobial effect; response surface methodology

　 1 目

　录

　1 引

　言........................................................................................................................................... 2 1.1

　食品防腐剂及现状 ......................................................................................................... 2 1.3 ε-聚赖氨酸研究综述 ........................................................................................................ 3 1.3.1 来源及理化性质 ..................................................................................................... 3 1.3.2 抑菌机制 ............................................................................................................... 3 1.5 天然防腐剂的前景 ........................................................................................................... 4 1.6 天然防腐剂应用存在的问题 ........................................................................................... 4 2 材料与方法 ................................................................................................................................... 4 2.1 材料试剂及仪器 ............................................................................................................... 4 2.1.1 菌种 ........................................................................................................................ 4 2.1.2 主要试剂 ................................................................................................................ 4 2.1.3 主要仪器 ................................................................................................................ 5 2.2 方法 ................................................................................................................................... 5 1.2.1 试剂制备 ............................................................................................................... 5 2.2.2 菌种活化 ................................................................................................................ 5 2.2.3 菌液制备 ............................................................................................................... 5 2.2.4 单因素实验 ........................................................................................................... 6 2.2.5 响应面优化试验设计 ........................................................................................... 6 3

　结果与分析 ................................................................................................................................. 7 3.1 不同浓度溶菌酶对大肠杆菌及枯草芽孢杆菌抑菌活性影响 ....................................... 7 3.2 不同浓度 ε-聚赖氨酸对大肠杆菌及枯草芽孢杆菌抑菌活性影响 ............................. 7 3.3 不同作用时间溶菌酶对大肠杆菌及枯草芽孢杆菌抑菌活性影响 ................................ 8 3.4 不同作用时间 ε-聚赖氨酸对大肠杆菌及枯草芽孢杆菌抑菌活性影响 ........................ 9 3.5 响应面实验结果分析 ....................................................................................................... 9 3.5.1 枯草芽孢杆菌响应面结果以及分析方差 ........................................................... 9 3.5.2 枯草芽孢杆菌的响应面分析 ............................................................................. 11 3.5.3 大肠杆菌响应面结果以及分析方差 ................................................................. 14 3.5.4 大肠杆菌的响应面分析 ...................................................................................... 16 4

　讨论........................................................................................................................................... 20 参

　考

　文

　献 ............................................................................................................................. 21 致

　谢............................................................................................................ 错误! 未定义书签。

　 2 溶菌酶及 ε-聚赖氨酸抑菌活性的响应面优化 1 引

　言

　1.1

　 食品防腐剂及现状 自古以来，食品防腐与人们的生活密不可分。化学药品合成食品防腐剂问世之前，已有许多方法可以延长食品的保质期，如盐渍、糖渍、风干、烟熏、水储存和地下储存等 [1] 。随着食品工业的快速发展，人们对食物品质的追求也在不断提高，而很多食物都需要经过加工以及长途的运输之后才能被人们食用，传统防腐方法已不能满足其防腐需要，这对食品防腐工作提出了严峻的挑战，进而使化学上的成就也逐渐应用于食品工业。食品防腐剂能抑制引起食物中毒的微生物生长、防止食品变质、保持食品原有质量和食品的营养价值、延长食品保质期。因此，防腐剂的应用也是减少食物中毒的重要措施 [2] 。

　在食品工业中，常用的防腐剂主要有化学合成防腐剂，如苯甲酸及其钠盐、丙酸及其盐、山梨酸及其钾盐、对羟基苯甲酸酯类（尼泊金酯）等 [3] ，随着消费者对食品安全的是意识逐渐提高，发现化学合成防腐剂对人体健康存在潜在的风险及隐患，消费者对于化学防腐剂的安全性一直存在顾虑。相比之下，天然防腐剂因其抑菌效果好、绿色天然和无毒性的特点越来越受到人们的青睐，消费者对天然防腐剂的需求也日益增加。

　因此，天然防腐剂已成为一个热门的研究课题，它被广泛地研究和应用于食品工业。

　1.2 天然食品防腐剂 目前天然食品防腐剂按其来源可分为植物源防腐剂、动物源防腐剂和微生物源防腐剂 [3] 。植物源防腐剂主要有果胶分解物、琼脂低聚糖、香辛料提取物、中药提取物等；壳聚糖、鱼精蛋白质和蜂胶为动物源食品防腐剂 [4] ；微生物源食品防腐剂主要是自然界中的某些微生物本身或其代谢产物，用发酵等生物技术制

　 3 备，具有抑菌防腐的功效，是一种安全、无毒、天然高效的食品防腐剂 [5] 。常见的微生物源天然食品防腐剂有 ε-聚赖氨酸、乳酸链球菌肽、纳他霉素、泰乐菌素等 [6] 。

　1.3 ε-聚赖氨酸研究综述 1.3.1 来源及理化性质 1977 年，Shima.S 和 Sakai.H 通过对土壤中生物碱的大规模筛选，发现了一株白色链霉菌 Streptomyces albulus 346 通过对发酵液中碱性“非生物碱”的分离纯化，得到(ε-poly-L-Lysine, ε-PL ) [7] 。

　ε-PL 是在放线菌滤液中偶然发现的一种碱性氨基酸聚合物，由 25-30 个赖氨酸残基组成，分子量在 3600-4300 之间，没有固定的熔点，250℃以上开始软化分解 ，成品呈现为淡黄色粉末，吸湿性强，略有苦味 [8] ，易溶于水、盐酸，微溶于乙醇，但不溶于醋酸乙酯、乙醚等有机溶剂，生物可降解，安全无毒，红外吸收峰在 1680-1640cm-1 和 1580-1520cm -1 [9] 。

　1.3.2 抑菌机制

　 ε-聚赖氨酸具有较高的抑菌效果，低浓度时就有抑菌活性 [10] ；ε-聚赖氨酸的抑菌作用主要表现在如下 3 个方面:（1）影响细胞壁和细胞膜系统以及细胞膜通道的形成,造成渗流较小的分子,增加细胞外液的渗透压,阻止细胞物质的合成,当细胞膜破裂,使大分子物质溢出,最终导致细胞死亡,从而达到抑菌防腐效果 [11] 。(2)作用在遗传物质上，改变遗传性状。（3）作用于酶或者功能蛋白，影响蛋白质的合成和正常生理代谢功能。

　1.4 溶菌酶研究综述 1.4.1 来源、理化性质以及抑菌机制 水解酶专门作用于微生物细胞壁，因其具有溶菌作用而得名溶菌酶(lysozyme，EC 3.2.1.17 )又称为胞壁质酶（muramidase）

　[12] ，它广泛存在于人体的许多种组织中，包括禽类的蛋白、哺乳动物的蛋白、眼泪、唾液、血浆、乳汁等液体，以及微生物也含此酶，其中以蛋白含量最高 [13-16] 。

　 4 1.5 天然防腐剂的前景 由于人们生活水平的不断提高，人们对食品的要求也越来越高，更多的是对食品的要求：更多样化，更新鲜，更有营养，更健康，食品种类越来越多，特别是对防腐剂的要求 [17] 。

　ε-聚赖氨酸于 2003 年 10 月美国食品药物管理局批准其为安全食品保藏剂。在日本，已作为一种食品防腐剂进行使用并规模生产。2014 年，ε-聚赖氨酸被国家批准为食品防腐剂添加到食品保鲜中 [18] ，因此具有广阔的发展前景。

　1.6 天然防腐剂应用存在的问题 天然食品防腐剂已经成为食品防腐关注的焦点研究的热点，虽然天然食品防腐剂是高度安全的，但与化学合成防腐剂相比，它们价格昂贵，导致食品生产商的生产成本较高 [19] 。

　研究天然食品防腐剂的复配应用，有助于提高防腐剂的保鲜效果，降低成本。本文主要试验溶菌酶与 ε-聚赖氨酸复配的抑菌效果。

　2 材料与方法

　2.1 材料试剂及仪器 2.1.1 菌种 革兰氏阳性菌种 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis) 革兰氏阴性菌种 大肠杆菌（Escherichia coli)

　2.1.2 主要试剂 试剂名称 规格 生产厂家 ε-聚赖氨酸 食品级 浙江新银象生物工程有限公司 溶菌酶 食品级 浙江新银象生物工程有限公司

　氯化钠 分析纯 天津富宇精细化工有限公司 营养琼脂 分析纯 广州环凯微生物科技有限公司 营养肉汤 分析纯

　广州环凯微生物科技有限公司

　 5 2.1.3 主要仪器 仪器 型号 生产厂家 恒温培养箱 DHP-9272A 上海飞越实验仪器有限公司 超净工作台 SW-CJ-2D 苏州净化设备有限公司

　全自动高压灭菌锅 YXQ-SG46-280S 上海博讯实业有限公司 电热鼓风干燥箱 DHG-9070A 上海飞越实验仪器有限公司 恒温培养摇床 THZ-100 上海一恒科学仪器有限公司 电子天平 YP802N 上海精密科学仪器有限公司 数控低温保存箱 YC-300L 中科美菱低温科技股份有限公司 2.2 方法 1.2.1 试剂制备 ε-聚赖氨酸溶液制备：去离子水制备质量浓度为 0.02%-0.20%的ε-聚赖氨酸溶液备用，115℃灭菌，30min。

　溶菌酶溶液制备：去离子水制备质量浓度为 0.02%-0.20%的溶菌酶溶液备用，过滤除菌。

　1.2.2 培养基制备 培养基 操作步骤 营养琼脂 称取琼脂干粉 33g→1L 蒸馏水→搅拌加热至煮沸→分装后 121℃高压灭菌15min 备用 营养肉汤 称取肉汤干粉 18g→1L 蒸馏水→搅拌加热至煮沸→分装后 121℃高压灭菌15min 备用

　2.2.2 菌种活化 超净工作台中将枯草芽孢杆菌及大肠杆菌接种至斜面，接种后置于恒温培养箱中，37℃培养 24 小时。

　2.2.3 菌液制备 超净工作台中分别取上述少量活化后的枯草芽孢杆菌及大肠杆菌菌种放入装有 30mL 营养肉汤的 150mL 三角瓶中，摇床恒温培养，37℃、200rpm 摇床培养 24 小时。

　 6 2.2.4 单因素实验 超净工作台中取摇床培养 24 小时的枯草芽孢杆菌菌液 0.1ml 到试管中加入0.75%无菌生理盐水稀释至 10 -4 ，加入溶菌酶溶液 0.2%，使其质量浓度为 0%（加入无菌水，为对照组）0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.1%、0.12%、0.14%、0.16%、0.18%、0....