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    辣木籽油提取及对小鼠佐剂性炎症研究论文设计

    时间：2021-04-06 20:06:54 来源：蒲公英阅读网 本文已影响人 蒲公英阅读网手机站

    相关热词搜索：佐剂 小鼠 炎症

    　1 概述

    　 1.1 佐剂性炎症及危害性 炎症是临床上常见的症状，机体活性组织遇到损伤因子时，机体主动发生防御的反应，属于机体应对损伤时的自我保护的一种表现。炎症是机体面对损伤时出现的最重要的自我捍卫的一种方式，但是对机体会产生危害，根据其人体的身体素质不同，危害也不同。炎症会引起机体发热、白细胞数目增加、厌食、腹泻、心律失常、血压升高、发抖等全身像反应，肿、痛、红、热是临床上最常见的局部表现。炎症的病理过程有三种，存在于血管中、局部组织中还有细胞中，有血管反应、局部组织损伤、细胞增生。

    　临床上有两种炎症类型，一是慢性炎症，第二种是急性炎症，根据其作用时间决定的。急性炎症的发生大多是致炎因子在机体内存在，并且它对机体的刺激所引起的，当体内得到信号会促使使机体立即发生早期的反应，目前临床上以渗出病变为其特征，其发作快速，维持大约几天、一个星期或一个月，时间较短。急性炎症发生时，机体血管内产生的白细胞和抗体等，它们通过血管壁进入机体发生炎症的部位，与病原体结合，杀灭病原体，最后体内毒素被稀释，然后再进一步中和，其作用机制给修复炎症提供较好的环境条件。致炎因子在机体内长期存在是慢性炎症发生的主要原因，细胞内是慢性炎症感染的地方，致炎因子长期存在会导致慢性炎症发生，同时会损伤组织。各种器官的慢性炎症可以因其他方式的发生所导致，还可以从急性炎症转化而来。目前存在很多原因与慢性炎症的形成有关，相关研究显示，急性炎症老是反复发作，急性炎症也可能转化成慢性炎症的趋势，有的机体未出现相关明显炎症症状，还有一些其他方式，都可能是形成慢性炎症的发生的原因。慢性炎症治疗麻烦，耗时较长，需要较长时间，几月或几年都有可能，增生病变使其主要特征。

    　类风湿性关节炎（RA）是一种在自身免疫性疾病范畴的慢性炎症。在手掌关节、膝关节、腕关节等地方发生，早期有疼痛、肿胀、晨起关节僵硬、身体疲倦、消瘦等全身反应。晚期有关节强直、畸形以及关节功能损伤，继而可能影响心、

    　肺、肾等多脏器损伤，对患者的身心健康和生活质量带来严重危害[1] 。古书上早已记载 RA，自身正气不足和外感风邪湿热是其主要原因，中医上认为治疗 RA 应“祛邪活络,缓急止痛”[2] 。患 RA 的时间越长，导致残疾的可能性越高。并且 RA可带来其他并发疾病，这使得 RA 患者比一般疾病患者的病死率高[3] 。RA 的高致残率和高病死率给患者带来了巨大的心理压力和生活负担。目前 RA 的治疗药物有很多，临床上主要使用非甾体抗炎药、抗风湿药及糖皮质激素这三种药物[4] 。以上药物价格昂贵，药物不良反应众多，长期服药会带来其他副作用，危害患者身心健康。

    　1.2 辣木籽油的研究现状 辣木，印度大量种植，我国云南地区种植的辣木均是从印度引进而来，属于热带地区植物[5] 。辣木中含有大量油脂，被称为多功能植物，人们初识它时因其根有辣味，故称其辣木。研究表明，辣木自身具有大量的营养成分，氨基酸、矿物元素、纤维、蛋白质、油类、黄酮、多糖、维生素、甾醇、生物碱等大量存在[6] 。查看了有关古罗马时期的书籍，发现关于辣木的记载颇多，食用药用都有，古书上说辣木的花、叶、根、种子都有药食同源的功效。

    　查阅大量相关文献，辣木籽中含有丰富的人体所必须的氨基酸，有人体不能合成的氨基酸，也有人体可以合成但是需要的量赶不上合成的量的氨基酸，还有一些重要的药用活性，具有治疗失眠、增强体质、调节血压、控制血糖、缓解贫血、抑制病菌、预防肿瘤、治疗紫外线损伤等功效[7] 。查阅辣木籽油提取工艺的相关文献，最终比较得出索氏提取法是较好的方法，操作步骤简单、快速，使用少量试剂就可以提取大量有效成分，缺点是只能少量操作，不适合大生产[8] 。辣木具有消炎功效， 一些炎症疾病使用辣木来治疗，有很好的帮助。国外对辣木籽的研究较多，在其药用价值、营养价值等做出较多研究。国内相关研究不多，在辣木籽的提取工艺优化方面有较多成果，在食用安全性毒理学有具体研究，抗紫外线方面也有相关研究，但目前辣木籽的药理研究较少。近年来，辣木籽越来越被大众所认识，它具有的防病治病功效得到广大消费者认可，慢慢被保健品行业列入[9] 。在查阅大量辣木籽的相关文献之后，发现目前还没有人对其抗炎进行研究，因此通过探究其抗炎作用将对日后新药物的研发有较大帮助[10] 。由于辣木

    　籽在我国云南等地分布比较广泛，价格低廉容易获得，利用辣木籽油治疗炎症对普通的老百姓来说价格容易接受，探究其抗炎作用，对炎症的治疗具有一定的意义，具有切实的可行性。

    　2

    　实验材料与仪器

    　 2.1 实验动物

    　 小鼠：昆明种小鼠普通级，雌雄各半，购于安徽中医院大学小鼠饲养处，体重 18~22g。小鼠分笼饲养，室温条件，及时补充食物和饮水以供小鼠主动进食饮水，注意保持鼠笼和水瓶干净，经常清洗，经常更换垫料，保持干净等。

    　2.2

    　 实验药物与试剂

    　 辣木籽：市售一级，购于云南辣木生物科技有限公司； 石油醚：分析纯，购于益瑞化学试剂有限公司；布洛芬：购于湖北金龙福药业有限公司；蒸馏水；弗氏完全佐剂：购于褚瑞生物科技有限公司；吐温 80：分析纯，购于利恒化学试剂有限公司（辣木籽油使用前，按照高中低组的剂量适当加入吐温 80 和蒸馏水，在研钵中研磨成乳剂，灌胃使用）

    　 2.3

    　 实验仪器

    　 粉碎机：湖北仁益仪器仪表有限公司、旋转蒸发仪：RE-3000，北京瑞成伟业仪器设备有限公司、足趾容量测量仪:pv-200,成都康泰科技有限公司、试剂盒：北纳生物科技有限公司、酶标分析仪：北京洪亚新技术有限公司、血液分析仪：南京贝登医疗股份有限公司。

    　3 实验方法及测量指标

    　 3.1

    　 辣木籽油的提取

    　 将辣木籽剥壳放入打粉机中打成粉末，称量 20g 的辣木籽仁粉，放置于过滤纸中进行封口包好，将其放球形冷凝管中，再添加进 200 mL 的石油醚，用铁架台固定装置，接通冷凝管，通入冷凝水，进行加热回流提取操作 3 h，把提取到的提取液进行减压旋蒸除去其中的石油醚，最终得到辣木籽油成品，放入冰箱低温冷藏，为抗炎实验储存备用[11] 。

    　图 图 3.1 索氏提取辣木籽油 流程图

    　 3.2

    　 辣木籽油对小鼠佐剂性炎症的抗炎作用 3.2.1 分组给药及佐剂性炎症模型的制作 把 48 只雄性实验小鼠, 随机地分为 6 组, 标为正常组、模型对照组、辣木籽油高剂量组（6g/100ml）、辣木籽油中剂量组（4 g/100ml）、辣木籽油低剂量组（2 g/100ml）、阳性药(布洛芬 2 g/100ml)对照组, 每组分为 8 只。

    　除去当中的正常组，其余的 6 组分别用弗氏完全佐剂进行注射，用量为 0.1ml，在小鼠的右脚后足跖皮下注射，从而致炎。正常组则在同一个部位注射等体积的生理盐水。

    　当致炎 1 h 后对小鼠进行灌胃（20ml/kg），每天一次， 接连四天, 其中正常组小鼠用相同容积的蒸馏水灌胃处理，模型组小鼠也用相同容积蒸馏水灌胃处理。

    　3.2.2 测量指标 3.2.2.1 小鼠足趾肿胀程度的测定 测定操作前，用记号笔在小鼠后足踝处化一个圈作为标记，各个小组分别用足趾肿胀仪测定这时每只小鼠的足趾容积。

    　在致炎 1 小时、 24 小时、 48 小时、72 小时，各个小组分别用足趾肿胀仪测定这时每只小鼠的足趾容积, 然后用公式计算，得出肿胀度。

    　肿胀度(%)=(致炎后足趾容积值-致炎前足趾容积值)/致炎前足趾容积值×100%

    　 3.2.2.2

    　小鼠血清 NO 的测定 分组及给药同佐剂性炎症模型的制作。最后一次给药结束 1 h 之后, 对小鼠进行摘眼球取血后，取血试管放入水浴锅中，在水温 37℃下进行水浴加热, 再用转速为 3500 r/min 的离心机进行操作 10 min，分离其血清成分，而后按照试剂盒上的说明书步中的步骤进行依次操作, 放置与酶标仪当中，与 550 nm 的波长下进行测定其吸光度 A, 最后再按说明书上的计算公式进行计算实验小鼠的血清 NO 的含量。

    　3.2.2.3 小鼠血清白细胞数目的测定 分组及给药同佐剂性炎症模型的制作。最后一次给药结束 0.5h 之后，各组小鼠分别进行摘眼球取血操作，采集血量，其中约一半的血液用于测定小鼠白细胞数目，在血液分析仪上分析小鼠白细胞数目。

    　3.2.2.4 小鼠血清炎症因子数目的测定 分组及给药同佐剂性炎症模型的制作。各组小鼠分别进行断头取血操作，以肝素抗凝，3000r每分钟离心10分钟，取上层清液。用小鼠elisa试剂盒检测IL-1β、IL-6 及肿瘤坏死因子 TNF-α 的分泌水平，操作步骤按照试剂盒说明来进行。

    　3.2.3

    　统计学分析 本实验的数据统计分析采用 SPSS 19.0 版软件,以均数±标准差( x±s)表示计量资料,采用单因素方差分析和 LSD-t 检验比较各组间差异,以 P<0.05 为差异有统计学意义。

    　4 实验结果 4.1 辣木籽油对小鼠足肿胀度的影响 表 表 4-1

    　辣木籽油 对小鼠足趾肿胀度的影响( X±S,n=8)

    　组别 给 药 浓 度（g·ml -1 ·d -1 ）

    　 不同时间小鼠足趾肿胀程度

    　1h

    　24h

    　 48h

    　 72h 空白对照组

    　3.1 ± 5.8

    　3.2 ± 4.1

    　3.3 ± 5.0

    　3.1 ± 1.6

    　模型组

    　65.5 ± 13.8 *

    　51.6 ± 23.8 *

    　32.8 ± 16.5 *

    　21.4 ± 15.8 *

    　阳性药对照组（2g/100ml) 0.08 18.6 ± 13.7

    　9.1 ± 7.6

    　4.9 ± 5.6

    　3.1 ± 4.3

    　辣木籽油低剂量组 （2g/100ml) 0.08 26.7 ± 10.2

    　29.7 ± 12.2

    　24.2 ± 13.6

    　7.6 ± 8.6

    　辣木籽油中剂量组 （4g/100ml) 0.16 39.4 ± 15.0

    　27.2 ± 19.9

    　18.7 ± 13.9

    　5.5 ± 2.4

    　辣木籽油高剂量组 （6g/100ml) 0.24 19.2 ± 12.0 *

    　16.9 ± 14.7 *

    　10.5 ± 9.3 * *

    　3.3 ± 6.2 * *

    　 注：与空白对照组比较* p<0.05，**p<0.01

    　 从表 4-1 分析数据可以看出，测量辣木籽油对实验小鼠足趾肿胀度的影响程度，将模型组实验小鼠的肿胀度与准备好的空白对照组的小鼠进行比较，结果显示，模型组小鼠肿胀度很高，相比较而言差异显著，而通过灌胃高剂量的辣木籽油的实验组与模型组相比较显示，辣籽油高剂量组的小鼠足趾肿胀度显著低于与模型组。剩下两组辣木籽油组小鼠足趾肿胀度也低，都低于模型组。分析以上实

    　验数据，辣木籽油高剂量组与其他给药组相比，高剂量组的肿胀程度更低。

    　4.2 辣木籽油对小鼠血清 NO 的影响 表 表 4 4- -2 2

    　辣木籽油 对小鼠 血清 O NO 的影响（ （ X±S,n=8）

    　）

    　组别 给药浓度（g·ml -1 ·d -1 ）

    　血 清 中 NO 含 量C/μmol· ml-1

    　 正常组

    　29.79±22.14 模型对照组

    　 88.19±27.25 *

    　阳 性 药 对 照 组（2g/100ml) 0.08 60.35±20.32 *

    　辣木籽油低剂量组 （2g/100ml) 0.08 62.17±32.02 *

    　辣木籽油中剂量组 （4g/100ml) 0.16 55.63±29.19 *

    　辣木籽油高剂量组 （6g/100ml) 0.24 48.13±22.35 * *

    　注：与空白对照组比较* p<0.05，**p<0.01 从表 4-2 数据可以看出，辣木籽油对血清中 NO 含量的影响，模型对照组与正常组数据进行比较，模型对照组小鼠血清 NO 含量很高，其数值与正常组的有很大差距。辣木籽油组与模型组的数据进行比较，辣木籽油组血清中 NO 含量很低，而且辣木籽油（高剂量组）与比其他用药组的数据比较，高剂量组小鼠血清中 NO 含量更低。

    　4.3 辣木籽油对小鼠血清白细胞数目的影响 表 表 4-3 辣木籽油 对小鼠白细胞数目的影响（ （ X±S,n=8）

    　）

    　组别 给药浓度（g·ml -1 ·d -1 ）

    　小鼠白细胞数目 / L 正常组

    　6.35±1.26 模型对照组

    　18.47±2.27 * *

    　阳 性 药 对 照 组（2g/100ml) 0.08 7.56±1.48 *

    　辣木籽油低剂量组 （2g/100ml) 0.08 13.24±1.57 * *

    　辣木籽油中剂量组 （4g/100ml) 0.16 11.41±2.68 *

    　辣木籽油高剂量组 （6g/100ml) 0.24 8.32±1.47 *

    　注：与空白对照组比较* p<0.05，**p<0.01 从表 4-3 数据可以看出，辣木籽油对小鼠白细胞数目的影响，模型组小鼠与空白对照组的实验数据相比较，模型组小鼠的白细胞数目显著增加。与模型组相比较，辣木籽油组白细胞数目明显降低，而且辣木籽油（高剂量组）的白细胞数目比其他用药组更低。

    　4.4 辣木籽油对小鼠血清炎症因子数目的影响 表 表 4-4 辣木籽油 对小鼠血液中炎性因子数目的影响（ （ X±S,n=8）

    　）

    　组别

    　给 药 浓 度（ g·kg -1 ·d -1）

    　TNF-a IL-6 IL-1β 空白对照组

    　0.54±1.28 36.1±11.3 11.4±2.56 模型组

    　 1.93±1.65 * *

    　44.8±12.7 *

    　19.07±11.89 *

    　阳性药对照组（2g/100ml) 0.08 0.47±1.65 * *

    　38.7±16.7 * *

    　12.56±5.09 **

    　 辣木籽油低剂量组 （2g/100ml) 0.08 0.81±1.24 *

    　49.4±25.1 *

    　17.34±14.23 *

    　辣木籽油中剂量组 （4g/100ml) 0.16 0.70±1.32 *

    　45.2±13.8 *

    　13.71±9.28 *

    　辣木籽油高剂量组 （6g/100ml) 0.24 0.55±1.36 * *

    　38.6±23.5 * *

    　11.68±8.91 * *

    　注：与空白对照组比较* p<0.05，**p<0.01 从表 4-4 可以看出，辣木籽油对小鼠血液中炎性因子数目的影响，模型组与空白对照组的实验数据相比较，模型组的小鼠血液中的炎性细胞因子 IL-1β、IL-6、肿瘤坏死因子 TNF-a 分泌的数目较多。与模型组相比较，辣木籽油组炎性细胞因子 IL-1β、IL-6、TNF-a 分泌的数目较少，而且辣木籽油高剂量组炎性细胞因子的分泌数目更少。

    　5

    　实验结论

    　研究表明, 佐剂性炎症的发生均与肿胀度、血清 NO、白细胞数目以及炎症因子有关，炎症会导致血清 NO 含量升高，白细胞数目增多，炎症因子含量增加。从实验数据分析的结果上看，辣木籽油低中高剂量组与模型组的所有实验数据进行比较，足肿胀容积明显降低、小鼠血清 NO 含量显著降低、小鼠血液中的炎性细胞因子 IL-1β、IL-6、肿瘤坏死因子 TNF-a 分...

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