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    微生物降解3,5-二甲基苯酚研究进展及菌株筛选方案设计生物技术专业

    时间：2021-04-15 15:08:06 来源：蒲公英阅读网 本文已影响人 蒲公英阅读网手机站

    相关热词搜索：菌株 苯酚 降解

    　 1 微生物降解 3,5- - 二甲基苯酚的研究进展及菌株筛选方案的设计

    　目录 摘要................................................................ 1 Abstract ............................................................. 3 1 前言.............................................................. 3 1.1 酚类化合物的来源及危害 .......................................... 3 1.1.1 3,5-二甲基苯酚的性质及用途 ................................ 3 1.1.2 含酚废水来源 .............................................. 4 1.1.3 酚类化合物的危害 .......................................... 4 1.2 酚类化合物的处理方法............................................ 5 1.3 本课题研究意义及主要内容........................................ 5 2 微生物降解 3,5-二甲基苯酚的研究进展 ............................... 6 2.1 降解 3,5-二甲基苯酚的微生物..................................... 6 2.2 微生物降解 3,5-二甲基苯酚的途径................................. 7 2.3 微生物降解 3,5-二甲基苯酚的关键酶............................... 8 2.3.1 甲基羟化酶 ................................................ 8 2.3.2 3-羟基-5-甲基苯甲酸酯 6-羟化酶............................. 9 2.3.3 龙胆酸 1,2-双加氧酶........................................ 9 2.4 小结........................................................... 10 3 菌株筛选方案 ..................................................... 10 3.1 实验材料....................................................... 11 3.1.1 菌源 ..................................................... 11 3.1.2 培养基 ................................................... 11 3.1.3 主要仪器设备 ............................................. 11 3.2 实验方法....................................................... 11 3.2.1 3,5-二甲基苯酚降解菌的富集驯化 ........................... 11 3.2.2 3,5-二甲基苯酚降解菌的分离纯化 ........................... 12 3.2.3 3,5-二甲基苯酚降解菌的分类鉴定 ........................... 12 3.2.4 3,5-二甲基苯酚降解菌的降解性能研究 ....................... 12 3.2.4.1

    　菌株耐酚能力的测定................................. 12 3.2.4.2

    　各种环境因素对菌株降酚能力的影响................... 13 3.2.4.3 菌株对实际废水的降解研究............................ 13 3.3 小结........................................................... 13

    　 2 4 总结............................................................. 13 5 致谢.............................................. 错误! ! 未定义书签。

    　参考文献............................................ 错误! ! 未定义书签。

    　 3 微生物降解 3,5- - 二甲基苯酚的研究进展及菌株筛选方案的设计

    　1 前言 酚类化合物是一类具有挥发性的有机化合物,酚类污染物主要集中在含酚工业废水，含酚的工业废水来源非常广泛，主要来自于石油化工厂、焦化厂、煤炭生产厂、塑料厂、农药厂等。已有研究表明，煤化工业废水中含有复杂的酚类化合物，并且与其他废水相比，其含有更高更复杂的酚类化合物，包括有一元酚如苯酚、3,5-二甲基甲基苯酚等；二元酚如邻苯二酚、对苯二酚等；除此之外，还含有多元酚及其他酚类化合物。

    　与其他污染物相比较后，可以证实煤化工业废水是一类含有高浓度、复杂酚类化合物的难降解有机废水。由于酚类化合物具有毒性大和难降解的特点,其对环境造成了严重的污染，对生态系统产生了严重的影响。目前，含酚废水在我国水污染中已被列为最严重并且需要重点解决的有害废水之一。因此,寻找经济、高效的含酚废水处理方法己成为是环保方面的重要课题。含酚废水的成份复杂,采用传统的或单一的生物、化学和物理方法处理效率低下,很难达到污水综合排放标准[1] 。因此，本课题将综述微生物降解法降解 3,5-二甲基苯酚等酚类化合物，

    　1.1 酚类化合物的来源及危害 1.1.1 3,5- 二甲基苯酚的性质及用途 3,5-二甲基苯酚是酚类化合物中的一种难降解的高毒性有机化合物。3,5-二甲基苯酚分子式为 C 8 H 10 O，分子量为 122.18，是一种白色晶体,微溶于水,易溶于乙醇等有机溶剂。主要物性参数:熔点为 68℃ ,沸点为 219.5℃ ,相对密度为 0.968(20℃)。3,5-二甲基苯酚具有毒性和腐蚀性，易燃烧[2] 。

    　3,5-二甲基苯酚主要存在香料烟叶、主流烟气中，同时，3,5-二甲基苯酚等芳香族化合物是煤炭高温碳化的副产品。3,5-二甲基苯酚是重要的工业中间体,主要用于生产杀虫剂、香料、药物、抗氧化剂、抗生素、树脂粘合剂和维生素 E 等。还可以用作轧钢冷轧油添加剂，可延长冷轧油使用寿命。

    　 4 1.1.2 含酚废水来源 含酚废水中所说的酚是一些有毒酚类化合物的总称,主要来自生产中以 3,5-二甲基苯酚为原料的化工企业如生产杀虫剂、染料、防氧化剂、橡胶促进剂、香料、药物、树脂等等,以及在生产过程中易产生酚类副产物的工业部门，如煤气与烧焦工业的煤气厂、焦化厂、炼油厂、冶金、机械、玻璃制造、陶瓷等工业的煤气发生站、石油工业的煤油厂、页岩干馏厂、林厂化工厂、木材防腐厂、木材干馏厂、木材纤维厂等[3] 。

    　除了各种工业废水含有酚类污染物外,生活污水中也含有酚类化合物，含酚量约为 0.1-1.0mg/L;此外，粪便和一些有机物在分解过程中也会产生少量的酚类化合物,所以人类产生的大量粪便等污水也是水体中酚污染物的重要来源[4] 。

    　酚类化合物指的是芳香族碳氢化合物的含氧衍生物,基本结构是一个苯环上有一个或者多个羟基,同时还可能带有不同的取代基。按苯环上的羟基的数目可以把酚类化合物可分为一元酚、二元酚、三元酚等[5] 。根据其能否与水蒸汽一起挥发而分为挥发性酚和不挥发性酚,一般将沸点在 230℃以下的酚称为挥发性酚,沸点在 230℃以上的酚称为不挥发性酚[6] 。3,5-二甲基苯酚等芳香族化合物是煤炭高温碳化的副产品。由于随着煤作为一种能源的使用的增加，这种副产品在环境中的浓度将越来越高。因此，3,5-二甲基苯酚也是含酚废水中的一种主要污染物。

    　 1.1.3 酚类化合物的危害 我国生活饮用水水质标准规定挥发酚类不超过 0.002mg/L。当人体吸收了微量酚类化合物后，人体自身的免疫系统会对其进行攻击，解毒后通过尿液将酚类化合物排除体外。由于煤化厂，焦化厂等工业生产厂排放废水时，未对废水进行处理，或者处理效果不佳，此类废水排出后由于含有复杂且高含量的酚类化合物，由于含酚量远远超过人体的承受量，因此一旦此类水被人体吸收后，就将无法完全排出体外，那么剩余的酚类化合物将在人体的内脏组织中累积，使人体功能紊乱，导致不同程度的头昏、眩晕、恶心、呕吐、腹痛、衰竭、昏迷、精神不安、食欲不振等症状。

    　酚类化合物不仅会对人类产生影响，同时对水生生物也有危害，含酚废水排放至水体中，受污染环境水体中的动物吸收酚类化合物后就会在体内累积，并在食物链中传递，从而对水生生物的生产和生活带来巨大影响。

    　 5 酚类化合物还会影响微生物，酚类化合物是一种原生质毒物，可以与细胞内的蛋白质发生反应，并且不同浓度的酚类化合物与蛋白质反应后会导致不同程度的变性与失活。当酚浓度较低时，通过抑制细胞脱氧酶、氧化酶等功能酶的活性来抑制细胞的活性。当酚浓度较高时，可以使细胞蛋白凝固，与细胞膜上的氧化酶结合，导致细胞迅速死亡。酚类化合物污染可以明显降低微生物多样性指数、影响微生物酶活性[1] 。

    　1.2 酚类化合物的处理方法 酚类化合物是一类具有毒性且难以降解有机物，还是一些生产物质的基本原料，因此酚类化合物的处理和资源化技术成为国内外众多研究者们的热点研究对象。随着人们受酚类化合物的影响越来越深，人们对其认识也更加深入,含酚废水的处理技术也在不断发展。目前国内外工业上治理含酚废水的方法很多,按处理工艺不同可分为物理法、化学法、生物法等。物理法包括吸附法、萃取法、离子交换法、液膜分离法、膜技术法等；化学法主要包括有电解法、氧化法、沉淀法等；生物法则根据微生物代谢形式不同，可以分为好氧生物技术法和厌氧生物技术法。由于含酚废水中的污染物种类和数量有所差异,因而,处理含酚废水的技术也相应的有所不同,可以采用将各种处理方式相互结合的方法,探索出更好的处理方法。并且，随着生物技术的不断发展，越来越多的学者们把研究热点集中在微生物降解酚类污染物上，微生物降解法是目前处理效果很好的一种净化酚类污染物的方法,并且此种降解方法无污染，也没有副产物。如本课题中提出的微生物降解 3,5-二甲基苯酚，主要通过能够利用以 3,5-二甲基苯酚为碳源生长的微生物来实现的。微生物能够以 3,5-二甲基苯酚作为生长底物,利用其自身的新陈代谢作用将污染物分解为丙酮酸，乙酰辅酶等简单无污染的物质,从而达到净化污水保护环境的目的[6] 。

    　1.3 本课题研究意义及主要内容 石油化工、塑料合成和煤炭燃烧等工业的迅速发展，3,5-二甲基苯酚等芳香族化合物是此类生产的副产品。随着生产规模不断扩大，这种副产品在环境中的浓度将越来越高，含酚废水对环境的污染日益严重。因此，3,5-二甲基苯酚等酚类化合物的生产在给经济带来发展的同时，也给我们出了一个难题，即日益严重的环境污染问题。3,5-二甲基苯酚等酚类化合物的污染问题已经引起了学者们的广泛关注，寻找经济、便捷、高效的降解 3,5-二甲基苯酚等酚类化合物也就成了环保方面的一个重要课题。

    　 6 由于含酚废水成分复杂，很多研究表明，采用传统的单一的物理、化学或者生物处理方法效率都很低，虽然，采用多种技术相组合的方式处理含酚废水是更加有效的方法，且多种技术相结合的方式处理含酚废水，将会有更加广阔的应用前景，但目前学者们更加把目光集中在微生物降解 3,5-二甲基苯酚等酚类化合物上，微生物具有体积小，繁殖速度快；分布广泛，种类繁多；适应性强，降解酶具有专一性等优势。这些优势使得微生物在降解酚类污染物方面有着巨大的潜力。并且采用微生物降解3,5-二甲基苯酚还有高效，无污染等优点。因此，微生物法被认为是处理 3,5-二甲基苯酚等酚类化合物的理想方法，但有关微生物处理 3,5-二甲基苯酚的研究很少报道。

    　因此，本课题以 3,5-二甲基苯酚为研究对象，综述了国内外研究者们对于微生物降解 3,5-二甲基苯酚的研究进展，并结合已有的研究设计出降解菌的筛选方案，为环境中酚类化合物的生物强化处理技术提供了理论基础。

    　 2 2 微生物降解 3,5- - 二甲基苯酚的研究进展 2.1 降解 3,5- - 二甲基苯酚的微生物 对于 3,5-二甲基苯酚,许多种类的微生物在一定程度上都可以对 3,5-二甲基苯酚进行降解,包括是细菌、真菌和放线菌。但是这些菌株对 3,5-二甲基苯酚的降解程度和降解时间有很大不同，并且大部分的菌株都不能完全降解 3,5-二甲基苯酚。因此对于解决 3,5-二甲基苯酚等酚类污染物带来的污染问题来说,筛选出能完全降解3,5-二甲基苯酚，并且降解效果好的菌株来进行应用研究,是取得良好降解效果的前提。

    　目前发现对酚类化合物具有降解性能的细菌种类很多，包括假单胞菌（Pseudonomonas sp.）、红球菌（Rhodococcus）、芽孢杆菌（Bacillussp）、根瘤菌（Rhizobia）、醋酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）、克雷伯菌（Klebsiella）、罗尔斯通菌（Raistonia ）

    　、粪产减杆菌（Alcaligenes faecalis）等。已有的研究中，假单胞菌（Pseudonomonas sp.）、红球菌（Rhodococcus）都能够降解 3,5-二甲基苯酚，并且研究最多的是恶臭假单胞菌等假单胞菌的细菌对 3,5-二甲基苯酚的降解作用[1] 。

    　酚降解细菌对酚类化合物的降解速度，以及可降解的浓度都会受到酚类化合物自身的影响，目前酚降解细菌降酚性能方面的研究数据给出了有力的证据，分降解细菌不同时，其降解性能也会不同。

    　 7

    　 2.2 微生物降解 3,5- 二甲基苯酚的途径 到目前为止，大多数学者对于微生物降解 3,5-二甲基苯酚进行了深入研究，已经证实 3,5-二甲基苯酚的微生物降解主要是通过被氧化。

    　3,5-二甲基苯酚氧化分解的代谢途径主要是 3,5-二甲基苯酚首先在甲基羟化酶的作用下，氧化成 3-羟基-5-甲基苄醇，然后通过两种脱氢酶的继续氧化[7] ，生成 3-甲基龙胆酸，接着在龙胆酸双加氧酶的作用下打开苯环，生成 6-甲基马来基丙酮酸酯，然后在其他酶作用下，一步一步被氧化，最终作为碳源或者能源被微生物利用。

    　Hopper[8] 等研究提出在降解 3,5-二甲基苯酚等酚类化合物时，中间体有龙胆酸及其 3-和 4-甲基取代的同系物。Hopper＆Chapman（1971）等表明 3,5-二甲基苯酚被恶臭假单胞菌 NCIB 9869 代谢为 3-甲基龙胆酸酯，其被龙胆酸酯 1,2-二加氧酶裂解为 6-甲基马来酰丙酮酸。在 Hopper 等的研究中分离出了两种假单胞菌，尽管没有用假单胞菌 3,5 研究完整的化合物范围，但该生物体氧化了 3,5-二甲苯酚时，通过 αα-联吡啶基抑制的细胞悬浮液的作用形成了产物，分离和鉴定由 3，5-二甲苯酚产生的化合物。通过薄层...

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