挥发性盐基氮检测方法
挥发性盐基氮的测定 方法(一)
半
微
量
定
氮
法
1 、原理
挥发性盐基氮是指动物性食品由于酶和细菌的作用,在腐败过程中,使蛋白质分解而产生氨以及胺类等碱性含氮物质。此类物质具有挥发性,在碱性溶液中蒸出后,用标准酸滴定计算含量。利用弱碱性试剂氧化镁使试样中碱性含氮物质游离而被蒸馏出来,用硼酸吸收,再用标准酸滴定,计算出含氮量。
2 、试剂
2.1 氧化镁混悬液( 10g/L ):称取 1.0g 氧化镁,加 100mL 水,振摇成混悬液。
2.2 硼酸吸收液( 20g/L )。
2.3 盐酸 [c(HCL)=0.01mol/L] 或硫酸 [c(1/2H 2 SO 4 )=0.01mol/L] 的标准滴定溶液。
2.4 甲基红乙醇指示剂( 2g/L )。
2.5 次甲基蓝指示剂( 1g/L )。
3 、仪器
3.1 半微量定氮器
3.2 微量滴定管:最小分度 0.01mL 。
4 、分析步骤
样品处理:精确取 10g 试样(粉碎好的样品)于 200mL 磨口三角瓶中,加 100.0mL(V 总 ) 蒸馏水于振荡器上振荡 30 分钟, 4000 转离心。
蒸馏滴定:将盛有 2 0.0 mL 吸收液及 5-6 滴混合指示液的锥形瓶置于冷凝管下端,并使其下端插入吸收液的液面下,准确吸取 10.0mL ( V 分取 )上述样品上清液于蒸馏器反应室内,加 10 mL 氧化镁混悬液( 10g/L ),迅速盖塞,并加水以防漏气,通入蒸汽,进行蒸馏,蒸馏 5min 即停止,吸收液用盐酸标准滴定溶液( 0.01mol/L )或硫酸标准滴定溶液滴定,终点至蓝紫色。同时做试剂空白试验。
5 、计算式及结果表述:
挥发性盐基氮( W )以每 100g 样品含氮毫克数表示。
W — 样品中挥发性盐基氮的含量, mg/100g;
V 1 — 测定用样液消耗盐酸或硫酸标准溶液体积, mL;
V 2 — 试剂空白消耗盐酸或硫酸标准溶液体积 ,mL;
C — 盐酸或硫酸标准溶液的实际浓度, mol/L;
14 — 与 1.00mL 标准标准滴定溶液 [c(HCl)=1.000mol/L] 或硫酸标准滴定溶液 [c(1/2H 2 SO 4 )=1.000mol/L] 相当的氮的质量, mg;
m — 样品质量, g 。
结果的表述:报告算术平均值的三位有效数。
6 、允许差
相对误差≤ 10% 。
方法(二)
微
量
扩
散
法
1 、原理
挥发性含氮物质可在 37 ℃碱性溶液中释出,挥发后吸收于吸收液中,用标准酸滴定,计算含量。
2 、试剂
2.1 饱和碳酸钾溶液:称取 50k 碳酸钾,加 50mL 水,微加热助溶,使用上清液。
2.2 水溶性胶:称取 10g 阿拉伯胶,加 10mL 水,再加 5mL 甘油及 5g 无水碳酸钾(或无水碳酸钠),研匀。
2.3 硼酸吸收液( 20g/L )。
2.4 盐酸 [c(HCL)=0.01mol/L] 或硫酸 [c(1/2H 2 SO 4 )=0.01mol/L] 的标准滴定溶液。
2.5 甲基红乙醇指示剂( 2g/L )。
2.6 次甲基蓝指示剂( 1g/L )。
3 、仪器
扩散皿(标准型):玻璃质,内外室总直径 61mm, 内室直径 35mm ;外室深度 10 mm ,内室深度 5 mm ;外室壁厚 3 mm ,内室壁厚 2.5 mm ,加磨砂厚玻璃盖。
微量滴定管:最小分度 0.01mL 。
4 、分析步骤
将水溶性胶涂于扩散皿的边缘,在皿中央内室加入 1mL 吸收液及 1 滴混合指示液。在皿外室一侧加入 1.00mL 按方法(一)中第 4 条制备的样液,另一侧加入 1mL 饱和碳酸钾溶液,注意勿使两液接触,立即盖好;密封后将皿于桌面上轻轻转动,使样液与碱液混合,然后于 37 ℃温箱内放置 2 小时,揭去盖,用盐酸或硫酸标准滴定溶液 (0.100mol/L) 滴定,终点呈蓝紫色。同时做试剂空白试验。
5 、计算式同方法(一):
W — 样品中挥发性盐基氮的含量, mg/100g;
V 1 — 测定用样液消耗盐酸或硫酸标准溶液体积, mL;
V 2 — 试剂空白消耗盐酸或硫酸标准溶液体积 ,mL;
C — 盐酸或硫酸标准溶液的实际浓度, mol/L;
14 — 与 1.00mL 标准标准滴定溶液 [c(HCl)=1.000mol/L] 或硫酸标准滴定溶液 [c(1/2H 2 SO 4 )=1.000mol/L] 相当的氮的质量, mg;
m — 样品质量, g 。
6 、允许差
相对误差≤ 10% 。
=========================== ===========
几种常见的动物源性饲料中挥发性盐基氮的测定 挥发性盐基氮 total volatile basic nitrogen 物质,简称 TVBN。它是指肉蛋白质在微生物的作用下发生分解产生氨、胺类碱性含氮物质,这类物质易和有机酸形成盐,具有挥发性,称这类物质为挥发性盐基氮物质。肉中挥发性盐基氮物质含量的多少可以反应肉品质新鲜程度。
TVBN 值:100 克肉中所含挥发性盐基氮物质的毫克数。该值是肉品新鲜度指标。国家标准规定:一级鲜肉≤15mg/100g,二级鲜肉 15-25mg/100g,腐败肉≥25mg/100g。
挥发性盐基氮作为食品和水产品质量的重要指标,在近几年才被应用作为动物源性饲料产品的一个重要指标,主要反映动物源性饲料的新鲜度。
本试验通过参考 GB/T5009.44-2003《肉与肉制品卫生标准的分析方法》,结合动物源性饲料产品的实际情况,建立一种适用于动物源性饲料产品中挥发性盐基氮含量测定的简便方法。
1 1 、原理
动物源性饲料产品富含蛋白质,由于微生物的作用易发生腐败,使蛋白质分解产生氨及胺类等碱性含氮物质,称为挥发性盐基氮物质。此类物质具有挥发性,用凯氏定氮法在碱性环境中将挥发性盐基氮物质蒸馏出来后,用硼酸接收,再用标准盐酸滴定,计算含量即为 TVBN 值。
2 2 、
仪器与试剂
2.1 仪器
实验室用样品粉碎机:刀片式高速粉碎机;分析天平:感量 0.0001g;半微量凯氏蒸馏装置:水蒸汽蒸馏式;振荡机;离心机;匀浆机;微量滴定管:最小分度 0.01 mL。
2.2 溶液的配制
2.2.1 c=0.01mol/L 盐酸标准溶液(无水碳酸钠标定):吸取分析纯盐酸 1mL,用蒸馏水定容至 1000mL,标定。
2.2.2 2%硼酸溶液:分析纯硼酸 2g 溶于 100mL 水配成 2%溶液。
2.2.3 混合指示剂:甲基红 0.1%乙醇溶液,溴甲酚绿 0.5%乙醇溶液,两溶液等体积混合,阴凉处保存期三个月以内。
2.2.4 1%氧化镁溶液:分析纯氧化镁 1.0g 溶于 100mL 蒸馏水振荡成混悬液。
2.2.5 防泡剂:不含氮、主成分为有机硅的固态或液态试剂。
3、 测定步骤
3.1 试样的处理
按饲料采样方法制备试样 , 要求粉碎细度能一次性达 95%以上过 CQ16(相当于 40 目)筛,粉碎样品充分混合后(筛上、筛下的全部筛分范围样品)装入磨口瓶中备用,在粉碎样品时,磨膛不能发热。
称取 10g 试样(精确到 0.0001g)于 250mL 具塞锥形瓶中,加蒸馏水 100mL,振荡摇匀 30min。鱼粉和蚕蛹粉等原料采用过滤,滤液为样液;而血浆蛋白粉、血球蛋白粉、鱼溶浆等不易过滤的原料采用离心,在离心机上于 1 500g(大约 3000r/min)离心 10min,上液为试样液。
3.2 蒸馏
取 20mL2%的硼酸溶液于 150mL 锥形瓶中,加混合指示剂 2 滴,使半微量蒸馏装置的冷凝管末端浸入此溶液。蒸馏装置的蒸汽发生器的水中应加甲基红指示剂数滴,硫酸数滴,且保持此溶液为橙红色,否则补加硫酸。准确移取 10mL 样液注入蒸馏装置的反应室中,用少量蒸馏水冲洗进样入口,再加入 10mL1.0%的氧化镁溶液,不起泡的动物源性饲料不加防泡剂,而易起泡的动物源性饲料产品,例如血浆、血球、血粉等必须滴加 1g 固体(或 0.5ml 液体)防暴剂,在入口处加水封好,防止漏气,蒸馏 4min,使冷凝管末端离开吸收液面,再蒸馏1min,用蒸馏水洗冷凝管末端,洗液均流入吸收液。
•
蒸馏。吸收氨后的吸收液立即用 0.01mol/L 盐酸标准液滴定,溶液由蓝绿色变为灰红色为终点,同时进行试剂空白测定。
•
结果的计算
挥发性盐基氮( TVBN)含量以(mg/100g)表示。
ω = [(V1-V2)*C*14/(M*0.1)]*100 式中 :
ω :样品挥发性盐基氮的含量 mg/100g;
V 1 ——滴定试样时所需盐酸标准溶液体积, mL;
V 2 ——滴定空白时所需盐酸标准溶液体积, mL;
C——盐酸标准溶液浓度,mol/L;
m:试样重量,g;
14:与 1.00mL 盐酸标准滴定溶液[c(HCl)=1.000mol/L]相当的氮的质量,mg。
4 4 、结果与讨论
4.1 不同试样制备方式对检测结果的影响
4.1.1 不同粉碎粒度试样对测试结果的影响
分别取未粉碎的鱼粉试样,粉碎至 40 目、60 目的鱼粉试样,按 3 的分析测试步骤进行分析,每种处理情况测试 5 次,测试结果见表 1。
表 1 不同粉碎粒度、不同试样处理方式对测定结果的影响
项目 振荡 30 min 处理
高速匀浆机 10min 处理
未粉碎
40 目
60 目
未粉碎
40 目
60 目
挥发性盐基 氮 ,mg/100g 150.1
148.3
152.4
147.5
153.4
215.7
221.4
217.9
218.5
220.1
225.3
219.8
220.8
223.4
221.3
215.4
214.8
217.5
216.8
219.7
220.3
219.8
220.8
217.5
222.6
224.5
221.3
223.2
222.6
219.9
平均值, mg/100g
150.3
217.7
223.5
216.8
220.2
222.3
根据单因子方差分析,在( a<0.05),未粉碎处理的样品与粉碎至 40 目和 60 目样品存在显著差异;而粉碎至 40 目和 60 目样品处理差异不显著。
4.1.2 不同试样处理方式对测试结果的影响
分别取未粉碎和已粉碎 40 目、60 目鱼粉试样用高速匀浆机匀浆 10 分钟,按 3 的分析测试步骤进行分析,测试结果见下表 1。
根据单因子方差分析,在( a<0.05),三种处理方式差异不显著。
4.2 本方法的重复性
分别取鱼粉、血球蛋白粉、血浆蛋白粉、血粉、膨化血粉等样品,每个样品测定 6 次,计算其标准偏差及变异系数,结果见表 2。
表 2 不同试样挥发性盐基氮(TVBN)含量测定的重复性
测定值, mg/100g
平均值 mg/100g
标准偏差 变异系数(%)
鱼粉
215.7,221.4,217.9,218.5,220.1
217.7
2.175
1.00
血球蛋白粉 1# 17.5,18.3,16.9,17.7,18.5
17.78
0.642
3.61
血球蛋白粉 2# 101.5,103.7,104.8,102.4,105.2
103.5
1.567
1.51
血浆蛋白粉 1# 15.2,13.9,14.6,15.6,16.1
15.08
0.858
5.69
血粉
554.7,537.1,547.0,558.3,571.3
553.68
12.771
2.31
膨化血粉
2215.2,2240.5,2198.7,2207.3,2168.9 2206.12
26.011
1.18
4.3 本方法的回收率
在以上 鱼粉、血球蛋白粉 中,按一定浓度的( NH 4 )
2 SO 4 溶液,按本方法进行测试,每个梯度重复测定五次,结果见表 3 。
4.4 本方法与 GB/T5009.44-2003 《肉与肉制品卫生标准的分析方法》半微量定氮法的比较。
4.4.1 本方法与 GB/T5009.44-2003 《肉与肉制品卫生标准的分析方法》适用范围的比较。
本 方法适用所有的动物源性饲料产品的挥发性盐基氮( TVBN)含量的测定; GB/T5009.44-2003 《肉与肉制品卫生标准的分析方法》半微量定氮法适用与鱼粉、肉粉等不起泡的产品 TVBN 测定;微量扩散法适用低含量所有产品的 TVBN 测定,但测定时间较长,方法较半微量定氮法烦琐。
4.4.2 本方法与 GB/T5009.44-2003 《肉与肉制品卫生标准的分析方法》测定结果的比较。
分别取鱼粉、血球蛋白粉、血浆蛋白粉、血粉、膨化血粉等样品,根据各方法的适用范围采用相应的方法测定挥发性盐基氮( TVBN)含量,测定结果见表 5。
表 3 方法的回收率( n=5 )
加入量
测得均值
平均回收率( % )
鱼粉
50.0
267.3
99.20
100.0
315.9
98.20
血球蛋白粉 2#
50.0
153.6
100.20
100.0
203.3
99.80
表 4 本方法与 GB/T5009.44-2003 《肉与肉制品卫生标准的分析方法》适用范围的比较
方法
适用范围
不适用范围
本方法
鱼粉、肉粉、血粉、血球蛋白粉、血浆蛋白粉、膨化血粉等 无
GB/T5009.44-2003
半微量定氮法
鱼粉、肉粉等不起泡产品
血粉、血球蛋白粉、血浆蛋白粉、膨化血粉等
微量扩散法 鱼粉、肉粉、血粉、血球蛋白粉、血浆蛋白粉
膨化血粉等高 TVBN 含量产品
表 5 本方法与 GB/T5009.44-2003 《肉与肉制品卫生标准的分析方法》测定结果的比较
单位:
mg/100g
本方法 (n=5)
GB/T5009.44-2003
半微量定氮法 (n=2) 微量扩散法 (n=2)
鱼粉
217.7
218.5
215.7
血球蛋白粉 1#
17.78
/
17.9
血球蛋白粉 2#
103.5
/
102.7
血浆蛋白粉 1#
15.08
/
15.2
血浆蛋白粉 2#
57.94
/
58.2
血粉
553.68
/
551.8
膨化血粉
2206.12
/
/
计算表明,改进后的测试方法与相适应的试验方法的测定值不存在显著差异,改进后的测试方法的测定结果准确可靠。
5 5 、结论
本试验建立了动物源性饲料产品中挥发性盐基氮的含量的测定方法,该法建立动物源性饲料产品样品处理、采用半微量蒸馏法直接测定氮含量,普通饲料企业常规质量检测条件下可以满足,具有提取效率高、易于操作等特点。通过研究表明:样品经粉碎处理,平均回收率可达 98%以上。该法针对几种常见的动物源性饲料挥发性盐基氮的含量测定设计,与国标法相比具有处理简便、回收率高的特点,同时具有重现性好、精密度高、操作简便、省时等优点。
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