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    生化实验报告-肝糖原测定

    时间：2020-11-23 11:42:33 来源：蒲公英阅读网 本文已影响人 蒲公英阅读网手机站

    相关热词搜索：肝糖 测定 生化

    　生物化学实验报告

    　姓

    　名：

    　学

    　号：

    　专业年级：

    　组

    　别：

    　 *** 实验教学中心

    　第一部分

    　一、实验目的

    　掌握程度 实验主要目的

    　1. 掌握肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法

    　2.正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器

    　3.熟练运用溶液混匀的各种方法（试情况而定，采用合适的混匀方法）

    　4.正确掌握溶液转移的操作

    　5、正确操作使用分光光度记 二、实验原理

    　掌握程度 实验内容及原理 实验名称

    　肝糖原的提取、鉴定与定量

    　实验时间

    　*** 实验地点

    　*** 指导老师

    　 赵***

    　 组员

    　*** 评分

    　批改日期

    　肝糖原的提取与鉴定

    　糖原储存在细胞内，采用研磨匀浆等方法可使细胞破碎，低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定保存于上清液中，从而使用糖原与蛋白质等其他成分分离开来。糖原不溶乙醇而溶于热水，故先用 95%的乙醇将滤液中的糖原沉淀，再溶于热水中。

    　糖原水溶液呈现乳样光泽，遇碘变红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖，利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可判断肝组织中糖原的存在。

    　CuSO 4 +2NaOH=Na 2 SO 4 +Cu(OH) 2 2Cu(OH) 2 +C 6 H 12 O 6 =2 CuOH+氧化型葡萄糖+H 2 O 2 CuOH= Cu 2 O (红色)+ H 2 O Cu(OH) 2 = CuO（黑色）+ H 2 O

    　肝糖 原定量测定

    　糖原在浓酸中可水解为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物—5-羟甲基呋喃甲醛，此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色化合物。该物质在 620nm 处有最大吸收。糖含量在 10~100ug,溶液颜色的深浅可与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量标准溶液比色，可得到样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶

    　液中非常稳定，故在显色之前，肝组织先置于浓碱中加热，以破坏其他成分，而保留肝糖原。

    　 一、

    　材料与方法

    　1、实验材料 样品

    　鸡肝

    　试剂

    　肝糖原的提取与鉴定：95%乙醇，0.31mol/L(5%)三氯醋酸溶液，浓盐酸，NaOH 溶液，碘试剂,班氏试剂。

    　肝糖原定量测定：30%KOH 溶液，0.5mg/ml 的葡萄糖溶液，蒸馏水，蒽酮显色剂。

    　仪器和器材

    　可见光分光光度计，恒温水浴箱，试管架，三支试管，加样枪，加样枪架，普通离心机，研钵，刻度吸量管，白瓷反应器，100ml 容量瓶。

    　2、实验流程 肝糖原的提取与鉴定：

    　鸡肝约 1.5 g，剪碎 ＋5%CCl 3 COOH 1 ml 研磨至乳状 ＋5%CCl 3 COOH 3 ml 研磨成肝匀浆

    　全部转入离心管中，离心 3 分钟（4000 r / min）

    　沉淀（弃去）

    　上清（取 3 ml）

    　＋3ml 95%乙醇，混匀，静置 10 分钟

    　离心 5 分钟（4000 r / min）

    　上清（弃去）

    　沉淀 ＋蒸镏水 1 ml 沸水浴 2 分钟，溶解沉淀

    　 白瓷板孔穴中

    　糖原溶液 1ml ＋浓 HCl 5 滴 加碘试剂 2 滴

    　 加碘试剂 2 滴

    　 沸水浴 15 分钟，冷却 糖原溶液 2 滴

    　 ＋50%NaOH 5 滴

    　 呈色对比

    　糖原水解液 2 滴

    　 糖原水解液 ＋班氏试剂 4 滴 混匀

    　沸水浴 2 分钟，观察变化

    　肝糖原定量测定

    　鸡肝 0.15 g ＋30%KOH 1.5ml

    　沸水浴 15 分钟

    　冷却，全部转入 100 ml 容量瓶中

    　加水至标线，仔细混匀，此为糖原提取液

    　糖原的测定

    　取 3 支试管，按下表操作。

    　试剂（ml）

    　空白管 标准管 样品管 蒸馏水 1.0 — — 标准葡萄糖溶液 — 1.0 — 糖原提取液 — — 1.0 0.2%蒽酮溶液 2.5 2.5 2.5 混匀，沸水浴 10 分钟，冷却c 。在分光光度计 620 nm 波长处，用空白管溶液调

    　零，测定各管溶液的吸光度（A）。

    　4、注意事项 肝糖原的提取与鉴定 ①在提取肝糖原中，向上清液中加入乙醇后，要充分混匀，可以用玻璃棒搅拌。

    　②糖原中葡萄糖螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基的多少有关。肝糖原分支中葡萄糖残基在 20 个以下，吸附碘后呈现红棕色。

    　肝 糖 原 定 量测定

    　 ①肝组织必须在沸水浴中完全溶解，否则影响比色； ②注意要收集全部溶液，用水多次洗试管，一并收入容量瓶中； ③加入蒽酮溶液时要小心操作，将试管放在试管架上进行； ④如果溶液呈浑浊，则因配制蒽酮溶液的硫酸浓度不够所致。

    　 第二部分

    　一、实验结果与处理

    　1、实验现象 操作过程 现象图片

    　（1 1 ）鸡肝在三氯醋酸中，被研磨成肝匀浆

    　(2) 鸡肝研磨成肝匀浆后转入试管

    　（3 3 ）第一次离心后

    　（4 4 ）第一次离心后上清液转移到另一试管

    　 （5 5 ）第二次离心后

    　（6 6 ）第二次离心后的沉淀

    　（7 7 ）沸水浴使沉淀溶解后

    　 （8 8 ）糖原水解液

    　（9 9 ）班氏试剂与糖原水解液反应：

    　溶液显蓝色，砖红色不明显

    　（ 10 ）

    　白瓷板孔穴中糖原与碘反应（左边为碘试剂与肝糖原溶液，右边为碘试剂）: :

    　紫色不明显

    　（ 11与 ）鸡肝与 30% 的H NaOH 溶液混合在沸水浴中加热后: :

    　呈血红色

    　（ 12 ）糖原溶液装入L 100mL 容量瓶混匀后：刻度线处有些许气泡，混匀过程造成

    　（ 13 ）糖原提取后的测定

    　，三支试管水浴后（1 1 、2 2 、3 3 号试管分别为空白管、标准管、样品管）：

    　三只试管水浴 10min后，标准管颜色最为明显，为绿色，加入的是标准葡萄糖溶液，样品管与空白管颜色依次递减。

    　 2、实验数据记录 在分光光度计 620nm 波长处，测定各管溶液的分光度（A），记录结果如下：

    　各管吸光值 测定次数

    　 空白

    　 标准

    　样品 1

    　 0.000

    　0.350

    　0.010

    　 2

    　 0.000

    　0.351

    　0.011

    　3

    　 0.000

    　0.353

    　0.013

    　3、实验结果

    　肝糖原的提取与鉴定：

    　显色反应中，碘液由黄色变为红棕色（不明显），说明所提供材料中含糖原成分，但含量低；加入班氏试剂的溶液无明显的颜色变化；

    　肝糖原定量测定

    　（1）鸡肝所取质量：0.15g （2）各管吸光值

    　各管吸光值 测定次数

    　 空白

    　 标准

    　样品 1

    　 0.000

    　0.350

    　0.010

    　 2

    　 0.000

    　0.351

    　0.011

    　3

    　0.000

    　0.353

    　 0.013

    　 平均值

    　 0.000

    　 0.351

    　0.011

    　标准管吸光度平均值 0.351； 样品管平均吸光度 0.011；

    　由公式计算：

    　11 . 1 *1000100*g100* 05 . 0 * 100 / g）

    　肝组织重（ 标准样品肝组织）

    　肝糖原（AAg 注：1.11 为此法测得的葡萄糖含量换算为糖原含量的常数，因为用蒽酮试剂显色时，110ug 糖原与 100ug 葡萄糖显色程度相当。

    　故经计算最后结果为 0.116(g/100 肝组织)。

    　 4、讨论与分析 （1）与碘试剂反应时：加入糖原的孔穴并没有出现明显的红棕色。可能原因如下：

    　A、是在取糖原沉淀时，沉淀很少，糖原含量也很少； B、碘试剂本身是黄色的，本来现象就不是很明显，这样一来，几乎看不到反应会产生的红棕色了，说明糖原含量极少。

    　（2）糖原中葡萄糖的鉴定：实验结果也没有如预期中的蓝色溶液沸水浴后变为砖红色。原因如下：

    　A、沸水浴过程水温没有达到 100 摄氏度，且期间多个小组先后放、取水浴箱中的试管，对反应造成一定影响； B、糖原含量极少，又加过少量酸与碱，浓度更小，现象更不明显，所以观察不到明显的砖红色。

    　（3）在肝糖原定量测定中，由资料可知饱食鸡肝的肝糖原含量为：2～3g/100g 肝组织。而我们的结果明显偏低，实验中没有出现操作上的失误，讨论分析原因如下：

    　A、所用鸡肝来源并非饱食鸡的肝，且鸡肝每个部位肝糖原的含量有差异，与其他实验组对比，可能我们组所取鸡肝的部位刚好是肝糖原含量较低的部位； B、查资料得知若肝糖原含量<1％时，蛋白质会干扰蒽酮反应，这可能对实验结果进一步造成降低的影响。

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