食品微生物检验技能操作考核方案与评分标准

时间：2021-04-02 06:05:37 来源：蒲公英阅读网 本文已影响人

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食品微生物检验技能操作考核方案与评分标准 本文简介：食品微生物检验技能操作考核方案与评分标准一、食品微生物检验技能操作试题本次考试有五组技能测试题供学生随机抽取，每一组题满分均为100分，占该门课程总成绩的70％。第一组：使用高压灭菌锅进行培养基的灭菌，并回答相关问题。第二组：微生物划线分离技术操作，并回答相关问题。第三组：食品中细菌总数的测定操作，

食品微生物检验技能操作考核方案与评分标准 本文内容：

食品微生物检验技能操作考核方案与评分标准

一、食品微生物检验技能操作试题

本次考试有五组技能测试题供学生随机抽取，每一组题满分均为100分，占该门课程总成绩的70％。

第一组：使用高压灭菌锅进行培养基的灭菌，并回答相关问题。

第二组：微生物划线分离技术操作，并回答相关问题。

第三组：食品中细菌总数的测定操作，并回答相关问题。

第四组：食品中大肠菌群测定，并回答相关问题。

第五组：常用仪器的使用

二、考试程序

1、组织学生抽取考试序号，按照此序号依次进行技能考试。

2、按照考试序号组织学生在考前5分钟抽取试题，拿到试题后可以准备5分钟，然后开始操作和回答。其他学生集中在另一教室等待。

3、考试完的学生不允许与等待考试的学生接触，要迅速离开考场，防止学生利用通讯工具交流试题内容。

三、评分标准

第一组

湿热灭菌操作

一、

一、操作用具及物品：高压灭菌锅、试管培养基、三角瓶、线绳、报纸或牛皮纸等。

二、操作过程及评分标准

1．首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。（10分）

2．放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。（10分）

3．加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。（10分）

4．用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。(或等压力上升到0.5时，打开放气阀排出冷空气)待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用

1．05kg/cm2，121．3℃，20分钟灭菌。（10分）

提问：1.为什么要放出冷空气？答：因空气是热的不良导体，当高压锅内的压力升高后，它聚集在锅的中下部，使饱和热蒸汽难与被灭菌物品接触。此外，空气受热膨胀也产生一种压力，致使压力数值达到要求，但灭菌温度却未达到相应指标，从而导致灭菌失败。（10分）

提问：2.斜面培养基湿热高压灭菌一般采用的时间和压力为多少？答：斜面培养基一般在0.104Mpa压力下，温度约达121℃，灭菌时间为20～30min。灭菌时间应从达到所需求的压力或温度时开始算起。（10分）

5．灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。（10分）

提问：为什么灭菌时间到了以后要冷却让压力自然下降到0，而不能快速放气？答：快速放气容易导致培养基从试管或者三角瓶中喷出。（10分）

6．将取出的灭菌培养基放入

37℃温箱培养24小时，经检查若无杂菌生长，即可待用。（10分）

提问：一般的试管斜面要摆多长比较合适？答：长度相当于试管长度的二分之一（10分）

第二组

微生物划线分离技术操作

一、操作用具及物品：

酒精灯

接种环

斜面培养物

打火机

牛肉膏蛋白胨琼脂平板

培养箱

记号笔

标签纸

酒精棉球

镊子

二、操作内容

将供试菌种采用划线的方法接种至固体培养基，培养过夜，要求出现单菌落

三、操作要求

1、无菌操作正确合理，样品无污染

2、划线操作合理规范

3、固体培养基无破损

4、正确标记样品

5、过夜培养后无杂菌污染

6、出现的单菌落不能过少，菌落线型较合理

7、原始记录简单明确

8、操作完毕整理台面

四、操作过程及评分标准

1、准备（5分）

实验着装

着工作服顺序正确，仪容整洁

整理实验台面

各种实验器材、试剂摆放有序合理

平板标注

平板标注清晰合理

2、灭菌（10分）

以酒精棉球擦拭手

操作动作倒位

擦拭实验台面

操作动作倒位、擦拭范围合理

擦拭菌种试管口

操作动作倒位

3、划线（45分）

（1）点燃酒精灯，灼烧接种环（5分）

操作动作倒位，火焰适宜靠近火焰，接种环灼烧红，注意接头部位的灼烧灭菌

（2）取菌

（10分）

试管握持姿势合理，拔棉塞、接种环冷却、试温、取菌、塞试管塞操作动作到位

（3）

划线操作（10分）

平板拿取、打开操作动作到位，划线方式、手法合理

（4）灼烧多余菌，固体培养基表面有无破损（5分）

接种环烧红

（5）划线完毕后平板倒置（5分）

操作动作到位

（6）操作熟练程度及整理印象（10分）

4、分离结果（20分）

（1）有无杂菌污染（5分）

（2）是否出现单菌落（10分）

出现单菌落，且有一定数量

（3）菌落线型（5分）

菌落线型合理、清晰，较为美观，无破损

5、实验报告（10分）

原始记录完整清晰，操作报告结果正确、简洁、规范

6、文明操作（10分）

有无器皿破损

，操作结束后整理现场

第三组

食品中细菌总数的测定（国标法）

一、操作用具及物品

试剂与设备：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基

蒸馏水

75%酒精酱油

电炉

恒温水浴锅

提前灭好菌物品：锥形瓶

试管

移液管

培养皿

其他：酒精灯

试管架

镊子

酒精棉球

打火机

吸耳球

记号笔

托盘

废液缸

二、操作内容与要求

1、检样处理，方法准确

2、检样10倍稀释，熟练正确，注意无菌操作

3、样品稀释液接种及与培养基混合，注意无菌操作，稀释与接种需在20分钟内完成

4、菌落计数与结果报告

5、整理，全部实验需在50分钟内完成

三、操作过程及评分标准

1、准备（7分）

物品摆放（2分）

有序合理，便于操作

试管编号（1分）

试管编号位置、数据正确

培养皿编号（2分）培养皿打开方法正确，标注位置、数据正确

培养基（2分）

加热熔化、温度控制合理

2、检样处理（12分）：

（1）点燃酒精灯（1分）

（2）

消毒（2分）

手、样品取样前消毒操作正确合理

（3）

取样（3分）：取样前混匀样品，移液管使用正确，取样量正确（准确制得10-1稀释液

（4）无菌操作（4分）：在酒精灯无菌区域内操作，取样放液各环节无菌操作正确

（5）混合均匀（2分）

震荡正确，时间不低于1分钟

3、10倍稀释（18分）：

（1）稀释度精确（3分）

稀释前混匀样品，取样量正确（准确制得10-2、10-3稀释液）

（2）移液管使用（5分）：移液管打开方法正确，取液、放液、读数操作规范，高浓度的移液管口不得伸入低浓度稀释液面下

（3）无菌操作（5分）：在酒精灯无菌区域内操作，取样、放液各环节无菌操作正确。

（4）混合均匀（2分）：更换移液管后混匀各试管，混匀方法正确

（5）整体印象（3分）：本环节操作规范、熟练

4、接种（15分）

（1）接种与稀释的顺序（4分）：正确做到边稀释边接种，移液管不得混乱使用

（2）加入样品（2分）：准确加入1ml稀释待检液，菌液浓度与培养皿标记一致。

（3）无菌操作（3分）：在酒精灯无菌区域内操作，取样、放液各环节无菌操作正确，培养皿持法正确。

（4）平行（2分）：每个稀释度接种两个平皿

（5）空白对照（2分）：准确加入1ml空白稀释液，一个平皿。

（6）整体印象（2分）：本环节操作规范、熟练

5、培养基（15分）

（1）加入培养基（4分）：准确快速倒入15-20ml融化培养基，不得污染皿壁

（2）无菌操作（3分）：在酒精灯无菌区域内操作，培养皿持法正确。

（3）培养基温度（2分）：培养基温度不得过高，不得出现结块现象

（4）混匀（4分）：混匀操作正确，不得污染皿壁/皿盖

（5）整体印象（2分）：本环节操作规范、熟练

6、综合评价（8分）

（1）实验熟练程度（3分）：理解实验原理，各环节安排合理，操作熟练

（2）时间（5分）：从稀释到完成接种时间不得超过20分钟，每超过1分钟扣1分

7、实验结果（15分）

（1）菌落计数（8分）：浓度选择合理，计数方法正确，原始数据记录正确、清晰

（2）结果报告（7分）：报告方法正确，结果正确

8、清场（5分）

（1）卫生（3分）：清扫实验环境及收拾垃圾，归位有序

（2）实验习惯（2分）：文明操作，实验习惯良好

9、时间（6分）

全部实验应在50分钟内完成，每超过1分钟扣1分，依此类推至本题分数扣完为止。

第四组

食品中大肠菌群的测定

一、操作用具及物品

1、试剂与材料

待检样品、乳糖胆盐发酵管、伊红美兰琼脂培养基、生理盐水、蒸馏水、酒精、结晶紫、碘液、95%乙醇、番红、二甲苯、擦镜纸、酒精棉球

2、用具与设备准备

培养皿、接种环、酒精灯、打火机/火柴、试管架、镊子、载玻片、盖玻片、记号笔、托盘、废液缸、水浴锅

二、操作内容与要求

1、大肠菌群检测步骤，了解每一步的操作要求与结果判断；

2、正确判断初发酵实验结果；

3、平板分离，划线操作；

4、平板分离结果判断；

5、革兰低染色，操作正确；

6、染色结果判断，显微镜正确使用；

7、结果报告，根据提供的实验结果能进行正确报告；

8、整理，全部实验需在50分钟内完成。

三、操作过程及评分标准

1

初发酵（6分）

（1）结果判断2分

结果判断正确，能正确开展下一步实验

（2）正确记录4分

正确记录初发酵实验结果

2

平板分离（18分）

（1）平板选择（2分）

平板个数选择正确，标注正确

（2）准备（2分）

点燃酒精灯，操作者双手消毒制作正确

（3）取菌

（4分）

在酒精灯无菌区域内操作，取菌各环节无菌操作正确

（4）划线

（4分）

平板拿取、打开手法正确，划线方法、手法正确

（5）灼烧多余菌液（1分）

接种环灼烧红

（6）结果

（3）分离培养基表面划线痕迹清晰可见，无刺破现象，每刺破一处扣1分

（7）整体印象（2）分操作规范流畅

3

革兰低染色（28分）

（1）前一步骤结果判断（2分）

对平板分离结果进行正确判断和记录

（2）准备（2分）

点燃酒精灯，载玻片准备

（3）涂片（6分）

液滴大小合适，正确选择典型单菌落，取菌方法正确，涂片薄且匀，灼烧多余菌液

（4）干燥与固定（2分）

干燥、热固定方法正确，温度不能过高

（5）初染

（2分）

染色方法、时间正确

（6）媒染

（2分）

残水去除、染色方法、时间正确

（7）脱色

（3分）

脱色方法正确，终点判断准确

（8）复染

（2分）

染色方法、时间正确

（9）干燥

（2分）

各步骤中干燥方法正确，菌膜完整

（10）水洗

(2分)

各步骤中水洗方法正确

(11)

整体印象(3分)

各环节操作规范流畅

4

镜检（18分）

（1）显微镜的安置（1分）

显微镜取、放方法正确

（2）载玻片的安置（1分）

正确使用标本夹和移动器

（3）显微观察

（2分）

从低倍到高倍

（4）油镜观察

（3分）

香柏油使用方法正确，得到清晰物象

（5）染色结果判断（5分）

结果正确

（6）显微镜的维护（3分）

油镜清洗方法正确

（7）整体印象（3分）

各环节操作协调熟练

5实验结果（15分）

（1）结果记录

7分

理解实验原理，熟悉每个实验步骤及结果判断，原始数据记录清楚、完整

（2）结果报告

8分

结果报告正确

6

清场（5分）

（1）卫生

3分

清扫实验环境及收拾垃圾，归位有序

（2）

实验习惯

2分

文明操作，实验习惯良好

7

实验时间

（10分）

全部实验应在50分钟以内完成，每超过1分钟扣1分，依此类推至本题分数扣完为止

第五组

常用仪器的使用

1、恒温恒湿培养箱的使用（40分）

设定温度37℃，湿度90%

（1）按设定键（10分）

各显示窗口末位数字闪烁，对应指示灯亮，此时可设定对应参数

（2）再按设定键（10分）设定结束

（3）按定时键（10分）

显示on，进入连续运行状态，

（4）再按定时键（10分）时间窗口不再显示on

，进入定时运行（本次设定）

2、鼓风干燥箱的使用（60分）

设定温度160℃，时间2小时

（1）将待灭菌的物品（培养皿、试管、吸管等）放入箱内（10分）

注意：物品不要摆放太挤，以免妨碍热空气流通。同时，灭菌物品也不要与箱内壁的铁板接触，以防包装纸烤焦起火。

（2）插上电源，打开开关（10分）

（3）按下Set键，设定温度（10分）

（4）再按下Set键，设定时间（以分钟计）（10分）

窗口显示0120（120分钟）

（5）再按Set键，设定完毕（10分）。

（6）开箱取物（10分）

待箱内温度降到70℃以下后，打开箱门，取出灭菌物品。

注意：箱内温度未降到70℃以前，切勿自行打开箱门，以防骤然降温导致玻璃器皿的炸裂。

篇2：托吡酯缓释胶囊的微生物限度沙门菌检查方法或是检查方法建议

托吡酯缓释胶囊的微生物限度沙门菌检查方法或是检查方法建议 本文关键词：检查，方法，沙门，微生物，胶囊

托吡酯缓释胶囊的微生物限度沙门菌检查方法或是检查方法建议 本文简介：托吡酯缓释胶囊的微生物限度沙门菌检查方法或是检查方法建议托吡酯缓释胶囊是拟交感胺类药物，具有与其原形药物（苯丙胺）相似的药理活性，通常被称为食欲抑制药物。该药用于慢性体重管理的作用可能是通过介导下丘脑释放儿茶酚胺从而降低食欲，减少食物消耗，但尚不明确其确切作用机制。尚不明确托吡酯用于慢性体重管理的确

托吡酯缓释胶囊的微生物限度沙门菌检查方法或是检查方法建议 本文内容：

托吡酯缓释胶囊的微生物限度沙门菌检查方法或是检查方法建议

托吡酯缓释胶囊是拟交感胺类药物，具有与其原形药物（苯丙胺）相似的药理活性，通常被称为食欲抑制药物。该药用于慢性体重管理的作用可能是通过介导下丘脑释放儿茶酚胺从而降低食欲，减少食物消耗，但尚不明确其确切作用机制。尚不明确托吡酯用于慢性体重管理的确切作用机制，其药理作用包括诱导增加神经递质γ-氨基丁酸的活性、调节电压门控离子通道、抑制氨甲基磷酸（AMPA）/钾盐镁矾激动的谷氨酸受体或抑制碳酸酐酶，这些作用可能与同时抑制食欲并增加饱足感有关。1）减肥药市场前景广阔21世纪，肥胖已成为最重要的公众健康挑战之一。肥胖与代谢综合症（心血管危险因素，包括高血压、脂肪代谢紊乱以及胰岛素耐受性）密切相关，并可减少寿命。据估计，有2/3的美国人超重或肥胖，此外，随着发展中国家越来越多的采用西方饮食和生活方式，肥胖病患者数量将进一步增加。据世界卫生组织估计，全球范围内超重和肥胖人群已超过14亿。2）竞争产品少：多种减肥药退市，医生难有更多治疗选择专家称，持续降低至少5%的体重，可降低肥胖及与肥胖相关的心血管疾病和糖尿病风险。根据监管机构发表的指导，减少体重的5%只是减肥的最低标准，而临床医生和患者则有更高的期望，他们希望减肥效果更明显，即至少减少体重的10%。在市场上可用的疗效适中的药物中，由于其耐受力差、安全性低、缺乏新疗法等原因，在本质上抑制了肥胖症治疗药物的市场发展。而近年来的减肥药纷纷退市风波对该市场和新药的开发更是雪上加霜。减肥药的主要问题在于其长期安全性。过去40年内，5种减肥药因安全隐患而退出市场。其中，最著名的两种药物为惠氏公司(已被辉瑞收购)的Pondimin（芬氟拉明）和Redux（右芬氟拉明）于1997年退出市场。这两种药物被发现可增加心脏瓣膜病变风险，上市仅一年便退出市场。最近退市的减肥药有雅培的Meridia/Reductil（西布曲明），由于可能引发心血管疾病于2010年退市；Servier公司的Mediator（苯氟雷司），由于可能引发心脏瓣膜病于2009年退市；赛诺菲的Acomplia（利莫那班），由于可能引发抑郁症或自杀观念于2008年退市。使用最广泛的托吡酯缓释胶囊，属于安非他命的衍生物，数十年来因其价格低廉而非疗效显著或安全可靠而在使用。其他常用的减肥处方药为脂肪酶抑制剂奥利司他（市场上的Xenical和非处方药Alli），由于奥利司他经常会导致肠胃不适（如大便失禁或油性大便），也限制了其进一步使用。不过，随着西布曲明在欧洲的退市，奥利司他已成为该地区唯一可以用于减肥的药物了。

在我国市场，2009年1月，由于会引发心脏损害等严重不良反应，SFDA要求在全国范围内，禁止生产销售和使用盐酸芬氟拉明片及其原料药。2010年10月30日，SFDA发出通知，决定停止西布曲明制剂和原料药在中国的生产、销售和使用，已上市销售的药品，由生产企业负责召回销毁。这一纸通知，终结了以“曲美”为代表的西布曲明系列减肥药在中国长达10年的销售历史。3）盐酸托吡酯缓释胶囊托吡酯制剂产品上市令人期待：肩负着扩充减肥药市场的重任在当前FDA新近批准上市的减肥药物中，Qsymi（盐酸托吡酯缓释胶囊托吡酯制剂）的效果最接近医生和病人的期待，可使体重减少10%。但是，成分中的托吡酯具有出生缺陷的风险（唇裂或腭裂），增加剂量则可引发嗜睡症以及感觉异常。针对Qsymia建立的风险评估和减灾对策（REMS），包括对育龄患者进行每月孕检，以及在专门的邮购药店配发等。相反，Belviq安全性更高，耐受性更好，但平均减重只能达到3%~4%。而依据美国缉毒署的化合物申请日程，Qsymia有可能于2012年底前上市，目前处于待生产状态，Belviq将于2013年年初上市。5.

国内上市及知识产权情况国内无盐酸托吡酯缓释胶囊和盐酸托吡酯缓释胶囊托吡酯缓释胶囊的产品上市。托吡酯原料国内已有进口。当前国内仅有一家企业恒瑞医药刚（2013.2）进行盐酸托吡酯缓释胶囊和盐酸托吡酯缓释胶囊托吡酯缓释胶囊的新药（均化药3类）临床申请。

篇3：微生物降解石榴单宁为鞣花酸的研究-科技项目申报书

微生物降解石榴单宁为鞣花酸的研究-科技项目申报书 本文关键词：降解，石榴，微生物，项目申报，研究

微生物降解石榴单宁为鞣花酸的研究-科技项目申报书 本文简介：项目类别研究类别编号资助经费项目基础研究山东省高等学校科技计划项目申请书（A）学科名称：生物技术学科代码：0710项目名称：微生物降解石榴单宁为鞣花酸的研究项目负责人：杨露所在学校：枣庄学院填表日期：2015年2月10日山东省教育厅制填表说明1.申请书为山东省高等学校科技计划项目的主要文件，是评审、

微生物降解石榴单宁为鞣花酸的研究-科技项目申报书 本文内容：

项目类别

研究类别

编

号

资助经费项目

基础研究

山东省高等学校科技计划项目

申请书（A）

学科名称：生物技术

学科代码：0710

项目名称：微生物降解石榴单宁为鞣花酸的研究

项目负责人：杨露

所在学校：枣庄学院

填表日期：2015年2月10日

山东省教育厅制

填

表

说

明

1.申请书为山东省高等学校科技计划项目的主要文件，是评审、立项和签订合同书的依据。各项内容须认真填写，表内栏目不能空缺，无此项内容时填“/”。

2.填写申请书前，请认真查阅《山东省高等学校科技计划管理办法》。申请书各项内容应实事求是，表达要明确、严谨。外来语要同时用原文和中文表达，第一次出现的缩写词，须注出全称。“项目名称”（中文）要准确、简明、具体，字数（含符号）不得超过30个汉字。

3．“学科名称”

和“学科代码”请按照《学位授予与人才培养学科目录》（2005年12月更新版）填写，封面上填写该项目所属的一级学科及代码，项目基本信息表中填写该项目所属二级学科及代码。

4.封面右上角的“项目类别”和“研究类别”与项目基本信息表相同。

5.“人才计划”指获得省部级以上人才计划资助者。

6.申请书及附件等书面材料均用A4纸双面打印，左侧装订，封面装订为纸质。

一、项目基本信息

项

目

概

况

项目名称

微生物降解石榴单宁为鞣花酸的研究

项目类别

A

A.

资助经费项目

B.

自筹经费项目

研究类别

A

A.基础研究

B.应用研究

申请

经费

0.1万元

学科名称

生物技术

学科代码

071005

起止

年限

2015

年

3

月

至

2016年

3

月

项

目

负

责

人

姓

名

杨露

性

别

女

出生年月

1993.10

身份

证号

610322199310100728

学

位

学位授予时间

职称

人才计划

联系电话

18463285657

E-mail

[email protected]

所在科技

创新平台

枣庄学院生命科学学院

所在单位

学校名称

枣庄学院

所在院系

生命科学学院

合作单位一

合作单位二

项

目

组

情

况

总人数

其中：教师职称情况

其中：学生情况

合

作

单位数

高级

中级

初级

博士生

硕士生

4

1

主要参加人员

姓

名

职

称

身份证号

工作单位

项目分工

签

名

张立华

教授

370404196803052911

枣庄学院

指导老师

杨露

610322199310100728

枣庄学院

单宁提取含量测定，微生物培养正交实验

杨荣爱

371202199501137128

枣庄学院

微生物培养正交实验

姜胜男

371083199404208024

枣庄学院

单宁提含量测定，微生物培养实验

主要

研究

内容

及

技术

经济

指标

（限200字）

研究内容：

筛选出能够降解石榴皮单宁为鞣花酸的微生物2-3种，并初步探索单宁降解酶的活性，研究不同条件下微生物对石榴皮单宁的降解效果，从而得出微生物降解石榴皮单宁为鞣花酸的最优条件。

技术指标：

1、微生物对石榴皮单宁的降解率达到70%以上。

2、鞣花酸产率达20%以上。

主题词（不超过3个）

石榴皮；单宁；鞣花酸

二、立项依据（包括项目研究意义，国内外研究现状、水平和发展趋势，并附主要参考文献）

项目研究意义：

植物单宁的利用涉及林化、制革、食品、制药、石油等众多行业，然而石榴作为枣庄市的特色农产品，栽培面积已达到15万亩，年产量13万吨。石榴皮渣为石榴加工的副产物，多被废弃，或低价销售给一些企业进行简单加工，利用率不高。目前研究表明石榴皮中除含有较高的单宁，本项目拟在得到筛选驯化得到可降解石榴皮单宁为鞣花酸的优质菌种，以提高石榴皮资源的利用率。

国内外研究现状、水平和发展趋势：

单宁(tannin)又称为鞣质，广泛存在于植物的叶、壳和果实以及树皮中，属于次级代谢产物。具有收敛性的涩味。Bate．Smith曾将单宁定义为：“单宁是分子量在500～3000的能沉淀生物碱、明胶及其它蛋白质的水溶性酚类化合物。”单宁可与粘膜或唾液中的蛋白质生成沉淀或聚合物，产生口腔组织粗糙褶皱的收敛或干燥的感觉，单宁还可以与多种金属离子结合生成难溶性物质。单宁具有很大的横截面，易与蛋白质发生疏水结合，同时还含有许多能转变为醌式结构的苯酚基，能与蛋白质发生交联作用，而这些结合产物都会产生涩感。

植物单宁的开发利用，涉及林化、制革、食品、制药、石油等众多行业。近年来，植物单宁的表面活性、与蛋白质、生物碱和多糖的反应、与金属离子的络合、对微生物和酶的抑制、抵御农作物病虫害。预防牲畜瘤胃臌胀病嘲、抗氧化及抗紫外等一系列重要的属性越来越多地被认识。目前，关于植物单宁应用基础以及开发利用的研究正日趋活跃。而对于其它高附加值精细化学品的研发和应用还不够深入，植物单宁及其衍生物的生物活性及其利用、植物单宁精细化产品的开发、植物单宁的降解与利用等，正成为国内外植物单宁研究领域的前沿性问题。已有的研究表明，植物单宁的利用与其分子量密切相关。分子量较大的单宁化合物收敛性强、颜色较深，适宜于作为制革鞣剂、粘合剂等使用；分子量较小的单宁化合物收敛性较温和，而且颜色浅淡、渗透性好，往往表现出更高的化学反应活性和生物活性。某些小分子酚类物(如桔酸、鞣花酸、花青素、儿茶素及其衍生物等)被较多地应用于化妆品、保健品、药物、食品等领域。因此，通过化学或生物降解获取高活性小分子多酚类化合物是植物单宁精细化利用的重要途径。

石榴的综合利用研究，是目前国外学者研究的一个热点。石榴皮含多种活性成分，以鞣质、类黄酮及齐墩果酸为主，其中鞣质含量最高，约10%~15%，类黄酮的含量约为5%~6%，齐墩果酸含量约为0.5%。石榴皮中提取的鞣质成分可用于鞣制皮革，但产品的附加值相对较低。而鞣花酸(ellagic

acid,EA)为石榴皮鞣质成份之一，具有抵抗肺癌、食管癌、抗氧化等作用。对人体免疫缺陷病毒、鸟的成髓细胞瘤病毒(AMV)的逆转录酶和

α-及

β-细胞

DNA

聚合酶的抑制性。石榴皮鞣质中游离的鞣花酸含量约为0.2%~1%，其余为鞣花酸的衍生物，即鞣花单宁。有研究表明鞣花单宁在酸性条件下可被水解为鞣花酸，鞣花酸的得率可达石榴皮干重的3.5%~5%。鞣花酸可作为医药、保健品、化妆品的原料，以石榴皮为原料制取鞣花酸可以大大提高产品的附加值。

单宁的化学或生物降解，可以获得具有更大应用价值的小分子活性物质。虽然化学降解具有降解速率快的优点，但降解程度不易控制，副产物多，产物的精细化利用受到限制。相反，生物降解具有条件温和及特异性强等特点，具有化学降解无可比拟的优势，可以获取理想的单宁降解产物。

单宁酶全称单宁酰基水解酶，是一种用途较广泛的水解酶，在开发茶饮叶新产品和改善天然食品的风味方面尤受重视。单宁酶用途广泛，它既可以水解单宁酸的酯键和缩酚酸键产生没食子酸和葡糖糖，也可以把没食子酸和丙醇合成没食子酸丙酯，还能水解茶叶中的酯型儿茶素，制备儿茶素单体，还可以作为食品添加剂用于开发茶饮料等。

主要参考文献：规范格式：如：张立华,孙晓飞,张艳侠,等.石榴花化学成分及生物活性研究进展[J].山东农业科学,2009,40(3):33-35.

微生物降解塔拉单宁为棓酸的研究

分泌涩柿单宁酶的微生物筛选及其酶特性的研究

黄文,石碧,李庆,等.利用多菌种共培养降解橡椀单宁制备鞣花酸[J].林产化学与工业,2002,01:21-24.

三、研究目标、研究内容和拟解决的关键问题

研究目标：

采用梯度驯化法得到对石榴皮单宁耐受较高的优质菌种，研究在不同条件下微生物对石榴皮单宁降解为鞣花酸的特性，从而得到本实验条件下石榴皮单宁降解为鞣花酸的较优条件。

研究内容：

（1）石榴皮单宁降解菌的培养与纯化

①野生菌种的获得：将自然环境中的石榴皮在恒温箱中培养得到野生菌种。

②将得到的野生菌种多次划线培养直到得到纯菌种。

（2）石榴皮单宁降解菌的筛选与驯化

将得到的微生物首先接种在含有溴酚蓝的1%的石榴单宁的培养基上进行菌种初筛，筛选的到的菌种接种在不同浓度的石榴单宁浸提物培养基中驯化，根据测量培养基的相关组分的变化和微生物的生长情况得到对石榴单宁耐受浓度较高的优质菌种。

（3）微生物降解石榴单宁为鞣花酸的工艺

通过正交实验对比温度、PH、碳源氮源补充等因素对石榴单宁降解和鞣花酸产率的影响，得到较优条件。

（4）石榴皮单宁降解酶的纯化与特性分析

分离纯化石榴皮单宁降解酶，掌握该酶的一些理化特性。

拟解决的关键问题：

（1）获得降解石榴皮单宁能力强的菌种。

（2）研究探索单宁降解酶的理化特性。

四、研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析

研究方法与实验方案：

1、单宁提取：酸提取法，有机溶剂回收。

2、野生菌种的获得：将自然环境中的石榴皮培养获得的野生菌种反复划线培养，直至得到纯菌种。

3、菌种驯化：将得到的纯菌种接种在含有溴酚蓝的1%的石榴单宁培养基上培养进行菌种初筛，筛选得到的菌种接种在不同浓度的石榴单宁浸提物培养基中驯化，测定保温培养后培养液中的COD值，计算COD的变化值，得出COD的变化率，以COD的去除率作为衡量单宁降解程度的指标，对菌种进行筛选，选取COD去除率较高的菌株。

4、先通过单因素试验确定石榴单宁浓度、氮源补充、培养温度、PH各因素与单宁降解率鞣花酸产率之间的关系；再选用7因素2水平正交表，以石榴单宁、鞣花酸的含量为考察指标，确定最优的培养条件。

5、培养基中的鞣花酸的纯化：单宁降解后续产生的沉淀用热吡啶溶解，冷却结晶，将结晶用冷水、热水、丙酮反复洗涤，然后真空干燥、称重，计算产率。

技术路线：

粗单宁提取，含量测定

野生菌种培养，纯化

单宁浓度、氮源补充、培养温度、PH单因素实验

1%没食子酸培养基筛选耐受单宁的菌种2~3种

四因素两水平正交实验。确定各菌种降解单宁的最优条件

可行性分析：

石榴皮单宁中的鞣花酸具有极强的抗氧化作用，具有防癌及抑制病毒的作用，在制药、生化、日化、食品以及精细化工等高科技领域具有广阔的应用前景，市场需求量大。随当前“追求自然”消费观念的兴起，从石榴皮中制取的植物源的鞣花酸倍受消费者的欢迎，也具有广泛的利用价值，市场前景十分广阔。

五、项目创新点

本项目针对石榴皮利用效率低的现象，研究以石榴单宁为原料通过微生物降解获得鞣花酸的方法，相对于以往的化学降解法具有降解产物易控制，降解过程绿色无污染等优点，充分提高石榴皮的利用效率，大幅度提高产品附加值。

六、项目负责人简历与已具备的研究基础、研究条件

项目主持人杨露，枣庄学院在校本科生，实验操作认真、严谨，做事负责，曾获得枣庄学院生命科学学院首届生化技能大赛三等奖。

项目组指导老师为枣庄市石榴工程技术研究中心研究人员，多年来一直从事石榴研究开发，在石榴研究面积累了丰富经验。

项目组成员均为枣庄学院在校本科生，曾分别获得枣庄学院生命科学学院首届生化技能大赛一等奖、三等奖。品德良好、勤奋吃苦、成绩优异，对实验报有严谨负责的态度

七、项目进度安排及提供成果形式和水平

2015年03月

至05月完成预实验，整理分析实验数据，根据实验中存在的问题寻找更进一步的解决方法。2015年06月至07月重复完成2~3次实验，得到更为优化的实验数据，整理分析数据。

2015年08月至9月完成论文。

八、经费概算（单位：万元）

申请经费

申请省教育厅经费

0.1

学校配套经费

其他自筹经费

总经费

支

出

科

目

预

算

用

途

1.实验材料费

0.1

原材料及提取、分析化学试剂

2.仪器设备费

/

/

3.实验室改装费

4.信息费

5.调研费

6.会议费

7.图书资料费

8.协作费

9.成果鉴定费

10.劳务费

11.项目管理费

合

计

其中：

仪器

设备

材料

名

称

规格型号

数

量

预

算

/

/

/

/

九、项目负责人承诺

我确认本申请书及附件内容真实、准确。如果获得资助，我将严格按照《山东省高等学校科技计划管理办法》和本申请书的规定，认真履行项目负责人职责，积极组织开展研究工作，合理安排研究经费，按时报送有关材料并接受检查。若申请书及附件内容失实或在项目执行过程中违反《管理办法》的规定，本人将承担全部责任。

负责人签字：*年*月*日

十、项目依托单位承诺

已经按照《山东省高等学校科技计划管理办法》与项目申报要求对项目申请人的资格及项目申请书内容进行了审核。项目如获资助，我单位将根据项目申请书内容，落实项目研究所需配套经费及其他条件；按照《山东省高等学校科技计划管理办法》有关规定，认真履行项目承担单位的管理职责。

学校公章

负责人签章

合作单位一公章

负责人签章

合作单位二公章

负责人签章*年*月*日*年*月*日*年*月*日

十一、项目申请书附件内容说明

1．项目负责人主要论文（3篇以内代表性论文），需包括论文首页及发表该论文刊物封面复印件；

2．承担省部级以上科研项目情况需提供项目批复函复印件；

3．获奖或专利情况需提供获奖或专利证书复印件；

4．已产生的经济和社会效益情况需提供相关证明材料；

5．人才计划证书复印件；

6．科技查新报告原件；

7．自筹经费项目出资证明原件。

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