外源基因瞬时转化烟草叶片研究论文设计

时间：2021-04-07 15:07:05 来源：蒲公英阅读网 本文已影响人

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　1 外源基因瞬时转化烟草叶片的研究 摘要：

　外源基因瞬时转化是当前植物分子生物学研究的热点之一，也是植物分子育种的基础之一。烟草是外源基因瞬时转化的模式植物，其研究以及通过转基因手段获得变异植株，为外源基因瞬时转化的基础研究奠定基础。本试验选取的烟草，以根癌农杆菌 EHA105 菌株为介导，来干涉本氏烟草的基因片段，以注射法转化烟草，获得转基因植株，并从形态、分子和遗传方面分析外源基因对植物外源基因瞬时转化的影响，为其基因的功能研究提供依据。应用实验室种植的烟草，通过转化，初步研究了烟草的多基因转化。通过烟草的品系选育，创造出新的烟草品系，为烟草基因工程的研究发展提供了便利，也为蛋白功能提供了一个便捷的技术。

　关键词：

　瞬时转化；外源基因；烟草叶片；转基因

　2 Transient Transformation Of Tobacco Leaves By Exogenous Genes Abstract: Transient transformation of exogenous genes is one of the hotspots in plant molecular biology and one of the bases of plant molecular breeding. Tobacco is a model plant of transient transformation of exogenous genes. Its research and the acquisition of mutant plants by transgenic means lay a foundation for the basic research of transient transformation of exogenous genes. The selected tobacco, mediated by agrobacterium tumefaciens EHA105 strain, interfered with the gene fragments of bens tobacco, transformed tobacco by injection to obtain transgenic plants, and analyzed the influence of exogenous genes on the instantaneous transformation of exogenous genes from the aspects of morphology, molecule and heredity, so as to provide a basis for the study of gene function. The polygenic transformation of tobacco grown in the application laboratory was preliminarily studied through transformation. Through the selection and breeding of tobacco strains, new tobacco strains are created, which provides convenience for the research and development of tobacco genetic engineering and a convenient technology for protein function. Key words:

　Instantaneous transformation ；exogenous gene； tobacco leaf； Transgene

　目录 摘要................................................................................................ 错误! 未定义书签。

　Abstract .......................................................................................... 错误! 未定义书签。

　引言................................................................................................................................ 1 1 材料与方法................................................................................................................ 2 1.1 实验材料.......................................................................................................... 2 1.2 实验方法.......................................................................... 错误! 未定义书签。

　1.2.1 菌种的活化........................................................... 错误! 未定义书签。

　1.2.2 烟草的遗传转化................................................... 错误! 未定义书签。

　1.2.3 烟草植株的种植.................................................................................. 3 1.2.4 外源基因瞬时转化烟草植株的 PCR 检测 ......... 错误! 未定义书签。

　1.2.5 外源基因瞬时转化烟草植株的抗生素筛选....... 错误! 未定义书签。

　1.3 烟草离体再生体系的建立.............................................................................. 5 1.3.1 植物材料烟草无菌苗的获得............................................................... 5 1.3.2 不同激素组合对不定芽形成的影响................................................... 5 1.3.3 不同激素组合诱导生根及移栽........................... 错误! 未定义书签。

　1.4 外源基因瞬时转化烟草叶片 Kan 的敏感性确定 ......................................... 6 1.5 外源基因瞬时转化的烟草再生植株的获得.................................................. 6 2 结果与分析................................................................................................................. 6 2.1 转基因烟草植株的 PCR 检测 ........................................................................ 6 2.2 转基因烟草种子和外植体筛选..................................................................... 7 2.3 烟草离体再生体系的建立.............................................................................. 8 2.4 受体植物叶片 Kan 敏感性的确定 ................................................................. 9 3 讨论........................................................................................................................... 10 3.1 选择合适的外植体对转化的影响................................................................ 10 3.2 试管苗移栽前后的管理................................................................................ 10 3.3 外源基因的转录水平.................................................................................... 11 结论............................................................................................................................ 122 参考文献.................................................................................................................... 133

　致谢............................................................................................................................ 155

　 1 引言 基因工程研究的蓬勃发展, 为实现植物品种的改良提供的方便。为了实现了烟草野生种、远缘种内、以及其他物种的优良基因向烟草栽培种的转移, 为烟草实现现有品种的改良、新品种的培育, 以及保健型、疗效型、药用型烟草的创新提供了崭新途径。烟草行业作为暴利、暴税的行业，他的发展自然引人关注，目前市面上存在许多的烟草品种改良实验。所以烟草可以说是作为基因工程研究的模式植物, 虽已目前市面上已经形成了比较完善的转化体系, 但是目前还有很多有利于烟草种植、生产、销售的外源转入基因尚未被发现。在大多数只把烟草作为模式植物的研究中, 自然可以忽略外源基因这个外来因素，但针对烟草进行品种改良的研究, 该因素就显得至关重要。根据上述情况, 我们对烟草叶片的外源基因插入种类进行了研究, 旨在建立一个简单、快捷、高效、稳定的烟草叶片外源插入基因，这为烟草基因工程的研究发展提供了便利。

　 2 1 材料与方法 1 1.1 实验材料 Kan、Str、Rif，pBR002－ VP7 穿刺菌，RNA 提取试剂，cDNA 反转录试剂盒，无 RNA 酶的枪头、EP 管、PCR 管、DEPC 水以及引物。

　烟草是经过实验室以一定的温度以及湿度和时间周期培育而成，在西北师范大学生命科学学院实验楼常规培育。农杆菌为实验室自行培养而保存的菌株，所含基因片段的转化载体均由实验室保存，实验用的酶和化学试剂均为分析纯。

　试剂的配置：

　Kan 储存液(50 mg/mL)、Str 储存液(100 mg/mL)、Rif 储存液(25 mg/mL)的配制，Cef储存液工作时的浓度为 500 g/mL。

　BA:浓度为 1 mg/5mL 。

　NAA:浓度为 1 mg/5mL 。

　基本培养基(MS 0 ):MS 固体粉末 4.74g/L、蔗糖 30g/L，用 NaOH 调至 pH 6.0 后，加入琼脂 7 g/L 。

　121℃高压灭菌 25 min。

　共培养基:在 MS 0 培养基的基础上添加 1.0 mg/L 6-BA 和 0.2mg/L NAA，调至 pH 6.0 后，加入琼脂 7g/L。121℃高压灭菌 25 min。

　外植体农杆菌侵染培养基:MS 固体粉末 4.74g/L、蔗糖 30g/L，调至 pH 6.0。121℃高压灭菌 25min。

　外植体筛选培养基:在 MS 0 培养基的基础上添加 1.0mg/L 6-BA 和 0.2 mg/L NAA,调至 pH 6.0 后，加入琼脂 7g/L。121℃高压灭菌 25 min。温度降至可用手触摸时便可加入 Kan，终浓度为 20 mg/L。

　外植体筛选生根培养基:在 MS 0 培养基的基础上添加 0.1 mg/L NAA,pH 6.0，之后加入琼脂 7g/L，121℃高压灭菌 25 min。待温度降至 50℃以下时加入 Kan 至浓度为 20 mg/L。

　2XCTAB 提取缓冲液(100 mL):0.5 mol/LEDTA(pH8.0)4mL,CTAB2g,2.5 mol/LNaCI 56 mL,1mol/L Tris-HC1(pH8.0)10 mL，加双蒸水定容至 100 mL。过滤后常温贮存，使用前加入 0.2% -巯基乙醇。

　

　 3 2 1.2 实验方法

　1.2.1 农杆菌的活化 将上海生工公司合成的 pBR002－ VP7 穿刺菌保存于-20℃冰箱。用接种针蘸取一环菌液，三区划线接种于含有 Amp 的 LB 固体培养基上，37℃培养箱中倒置 12－16h。用枪头挑几个经平板活化的单菌落接种于 4mL 含 Amp 的 LB 液体培养基中摇床 37℃、180rpm 过夜培养。

　同理将 PBI121 的保存菌株划线接种于含有 Kan 的 LB 平板上，37℃培养箱中倒置 12－16h。次日挑取几个活化的单菌落于 4mL 含 Kan 浓度 50μg/mL 的 LB 液体培养基中摇床 37℃、180rmp 过夜。

　1.2.2 烟草的遗传转化 (1)农杆菌悬液的准备

　①从农杆菌平板上挑取含有质粒 1121--7 的单菌落，接种于 SmL 含 Rif 和 Kan 的 LB液体中并置于 28℃、200 rpm 摇床培养。

　 ②次日，按照 1:50 的比例将 1mL 菌波加入 50mL 含有 Rif 和 Kan 的 LB 液体中，28C、200 rpm 摇床培养 4-5 h, 0D600 约为 0.5-0.6，即可转化烟草。

　 ③常温，4000rpm、10min 左右离心收集菌体，并用枪头吸取烟草重悬液，调节 0D600最终为 0.8-1,室温放置 2-3h 用以侵染烟草。

　(2)注射法侵染烟草 将长至五、六叶期的本氏烟草幼苗用去掉针头的注射器进行侵染。事先需要用一次性针头在叶片的远轴面制造伤痕以便于通过挤压活塞使农杆菌菌液缓慢进入伤口最终浸渍到叶片中。侵染后，将烟草置于黑暗条件下培养 1d 时长,而后正常光照培养。取侵染后 5d 的烟草叶片以及同阶段未被侵染的烟草叶片进行后续试验。

　1.2.3 烟草植株的种植 (1)将 60 粒泥炭颗粒放入繁殖盘中。

　(2)加入 4L 自来水，让泥炭颗粒吸水 2h。

　(3)向每个泥炭颗粒中加入 2 个本氏烟草种子，用透明塑料圆顶盖住托盘，让它们在25℃、84 湿度环境中以 16/8h 的昼夜周期发芽。

　(4)播种两周后取出圆顶，从托盘中排干水，加入 2L Jack-s 肥料，浓度为 1.48g/L，继续在 25℃、50 湿度的环境中种植烟草，每天 16/8h 的昼夜周期。每个托盘没 2 天供应 2L Jack-s 肥料。

　 4 (5)在第四周，将带有泥炭颗粒的烟草株转移到一个新的托盘上，托盘上容纳 6 株烟草植株，为进一步生长提供足够的空间，直到它们在 6 周龄时准备好渗入根癌农杆菌制剂。

　1.2.4 外源基因瞬时转化烟草植株的 PCR 检测 (1)烟草叶片的采集 分别采取转化后植株和对照植株的叶片，并对其标号，保存于实验室备用。

　(2)烟草基因组总 DNA 的提取 由于烟草叶片含较多酚类物质，在提取烟草基因组总 DNA 时，我们要对 CTAB 法进行了定的调整和优化。优化后的提取方法如下: ①取 0.4－0.6g 的备用叶片，将其研磨成细粉末，转入 1.5 ml 离心管中，加入 1ml CTAB(含 2%PVP)，65 ℃水浴 1h，其间轻轻混匀。

　②向离心管中加入 300 林 15 M 醋酸钾，静置 30 min。

　③4℃10000 r/min 离心 15 min。

　④将上清液转移至全新 1.5 ml 离心管，加异戊醇：2/3 体积氯仿(1：24)轻轻摇晃 15 min，充分混匀，室温下 10000 r/min 离心 10 min。

　⑤继续将上清液转移至新的 1.5 ml 离心管中，加入异戊醇，轻轻晃动离心管混匀，室温静置 30 min。

　⑥室温 10000 r/min 离心 15 min，弃上清。

　⑦70%乙醇洗涤沉淀 3 次，37℃烘干。

　⑧将沉淀溶于 50 ddH 2 O 中备用。

　⑨琼脂糖凝胶电泳。

　(3)PCR 检测 以转化的烟草植株和野生型植株的基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增，通过琼脂糖凝胶电泳分析。PCR 扩增反应总体积:20 ,其反应体系为: l L 

　 5

　扩增循环参数为: ①94℃预变性 3 min ②94℃变性 30 s ③59℃退火 45 min ④72℃延伸 1 min ⑤25℃保存。

　②一④程序进行 35 个循环。

　1.2.5 外源基因瞬时转化烟草植株的抗生素筛选 (1)外源基因瞬时转化的烟草外植体筛选 ①采摘若干长势良好的叶片作为外植体。

　②将外植体用水冲洗约 20 min，置于在超净工作台中的广口瓶内，75%酒精消毒 30 s，蒸馏水冲洗 3－5 次。0.1%升汞消毒 8-10 min，消毒后再蒸馏水冲洗 3－5 次。

　③至于灭菌的滤纸上，切成 0.8 cmx0.8 cm 的小块，接种于含 MS+2.25 mg/LBA+0.3 mg/L NAA+100 mg/L KM 的培养基上，一个月后观察分化情况。

　3 1.3 烟草离体再生体系的建立

　1.3.1 植物...