分支杆菌噬菌体Chy2分离及生物学特性研究

时间：2020-12-07 15:05:54 来源：蒲公英阅读网 本文已影响人

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　分支杆菌噬菌体 Chy2 的分离及生物学特性研究 刘平

　邬亭亭

　 彭丽

　郭述良*

　 罗永艾

　(400016

　重庆，重庆医科大学附属第一医院呼吸科，) [摘要] 目的

　分离鉴定新分支杆菌噬菌体并研究其生物学特性。

　方法 以平板法从泥土中分离纯化噬菌体，紫外线诱导法鉴定溶原性，从噬菌斑大小，颗粒形态和限制性内切酶分析3方面比较Chy2、D29、TM4异同；以不同感染复数(MOI)扩增Chy2，测定最佳MOI；通过一步生长实验测出Chy2潜伏期、裂解期和裂解量；采用单斑法测定MOI的裂解谱；检测MOI在不同pH值培养基中裂解耻垢分支杆菌mc 2 155的能力。

　结果

　成功分离纯化1株分支杆菌噬菌体，命名为Chy2，其噬菌斑圆形透明，紫外线诱导法处理宿主菌后不能形成噬菌斑，头部呈椭圆形，长尾，基因组核酸能被双链DNA内切酶EcoRⅠ，Hind Ⅲ，BamH I及XbaI切开，大小约54 kb，与D29、TM4差异大；Chy2最佳MOI为9.58×10 -5 ；Chy2一步生长周期为270 min，潜伏期210 min，裂解期60 min，裂解量为23；Chy2能裂解耻垢分支杆菌mc 2 155、结核菌标准株H 37 Rv、多数临床耐药株；在7H9固体培养基pH值为5.0和7.4时，Chy2均能裂解耻垢分支杆菌mc 2 155。

　结论

　Chy2属长尾噬菌体科，基因组为双链DNA，宽噬谱广，是一种潜在的抗结核药物资源。

　[关键词] 分支杆菌噬菌体；耻垢分支杆菌；结核分支杆菌；生物学特性；耐药结核病

　[中图分类号] R52 Isolation and biological characteristics of Mycobacteriophage Chy2

　Liu Ping, Wu Tingting, Peng Li, Guo Shuliang*, Luo Yongai(Department of Respiratory Medicine, the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing, 400016, China) [Abstract] Objective To isolate and identify a new mycobacteriophage and research on the biological characteristics to explore its potential of anti-TB treatment. Methods The new mycobacteriophage was isolated and purified by single-plate method from the soil. The phage was induced by ultraviolet ray (UV) to identify its lytic or lysogenic capacity. Chy2, D29 and TM4 were compared by the plaque size, particle morphology and the restriction enzyme analysis. The phage was amplified by double-layer agar plate method in different multiplicity of infection to find the optimal MOI. One step growth experiment was done to find the latent period, burst period and burst size of the phage. The host range of the phage was examined by single-spot examination. The ability of the phage to crack Mycobacterium smegmatis mc 2 155 at different pH values was examined. Results A new mycobacteriophage was successfully isolated and purified, which was named Chy2. The plaques of Chy2 are transparent and their sizes are about 3mm in the diameter, The host bacteria induced by UV can not form plaques. Chy2 has a oval head，a long tail, base plate and tail fiber. Chy2 is digested by restriction endonuclease EcoRⅠ, Hind Ⅲ , BamH I and XbaI and the size of genome is about 54kb. Chy2 is different from D29, TM4 in the plaque size, particle morphology and the restriction enzyme analysis. The optimal MOI and the highest titer of Chy2 are 9.58×10 -5

　and 7.2×10 10

　PFU/mL, respectively. The one-step growth cycle of Chy2 is 270 min, in which the latent period is 210 min, the burst period is 60 min and the burst size is 23. Chy2 can lysis Mycobacterium smegmatis mc 2 155 , Mycobacterium Tuberculosis H 37 Rv and the majority of clinical drug-resistant strains. Chy2 can crack Mycobacterium smegmatis mc 2 155 in solid medium with pH 5.0 and 7.4.

　Conclusion

　Chy2 belongs to Siphoviridae family, of which genome is a double-stranded DNA molecule. Chy2 has a broad host range and has the potential of anti-TB treatment. [Key words]: Mycobacteriophage; Mycobacterium smegmatis; Mycobacterium tuberculosis; Biological characteristics; Anti-drug tuberculosis Supported by National Science and Technology Major Project(2008ZX10303)*Corresponding author: Guo Shuliang, E-mail:

　噬菌体(Bacteriophage, Phage)侵入宿主菌后，随即引起宿主细胞裂解，利用这一特性可治疗感染性疾病[1] 。近年来，由于各种耐药性病原菌的出现，新型抗生素的研发越来越困难，而噬菌体作为一种抗菌剂，具有特异性强、自我增殖快、来源广等一些其它抗菌剂无法比拟的优点，随着大量噬菌体基因组的测序以及噬菌体疗法的技术手段逐渐成熟，噬菌体已成

　[基金项目] 国家“十一五”科技重大专项(2008ZX10303)

　 [通信作者] 郭述良，E-mail:

　为新型抗菌药物开发的研究热点之一[1-3] 。噬菌体疗法主要研究大肠杆菌、铜绿假单胞菌、葡萄球菌等快生长菌导致的感染，而结核分支杆菌为慢生长胞内寄生细菌，相关研究较少，D29和TM4是目前主要研究的2株分支杆菌噬菌体(Mycobacteriophage)[1-14] 。本研究在国内首次分离鉴定出1株分支杆菌噬菌体，命名为Chy2，通过对其生物学特性以及与宿主菌间的作用规律进行研究并比较其与D29和TM4的差异，为噬菌体Chy2进一步开发应用、人工改建为一种新型抗耐药结

　核生物制剂提供基础。

　1 材料和方法 1.1 分支杆菌噬菌体 Chy2 的分离和鉴定 1.1.1 标本及宿主菌

　标本为重庆医科大学附属第一医院结核病房花盆内的泥土，耻垢分支杆菌 mc 2 155 (CMCC 93202)、D29 由中国药品生物制品检定所王国治教授馈赠，TM4 由美国匹兹堡大学 Hutful教授赠送，结核分支杆菌标准株 H 37 Rv (CMCC 93004)购自重庆市肺科医院，分支杆菌临床分离株分离自本院结核病人痰标本(2010 年 3 月-2011 年 4 月)，罗氏药敏培养基(珠海贝索公司)鉴定菌种和检测药敏。扩增耻垢分支杆菌时采用 7H9 液体培养基(美国 BD 公司)，扩增其它分支杆菌时采用罗氏培养基(珠海贝索公司)，扩增噬菌体时采用 7H9、7H10 双层琼脂固体培养基(美国 BD 公司)，所有与结核分支杆菌(结核菌)相关的操作均在 P2 实验室进行。

　1.1.2 分支杆菌噬菌体分离纯化

　 参照 Hutful 等 [2] 的方法，略有改动，取泥土标本 5 份(标记为 1-5 号)，每份 5 g，分别加入 10ml 7H9 液体培养基(含 10％增菌液)，37 ℃摇床 160 转/min 振荡培养过夜，富集噬菌体。次日离心取上清，0.22 μm 滤器过滤除菌，取 100 μl 滤过液加入 3.0×10 7 CFU 耻垢分支杆菌 mc 2 155 中，室温孵育 15 min，再加入 7H9 琼脂固体培养基混合铺板，37 ℃培养过夜，24 h后 2 号标本有大小不一的噬菌斑出现，用 200 μl 枪头挑取圆形透明且直径最大的噬菌斑，加入 100 μl 7H9 液体培养基中，梯度稀释后用 7H9 单层琼脂平板反复铺板挑斑 5 次，直至噬菌斑形状、大小一致，即得纯化的噬菌体。噬菌体没有普遍应用的命名规则 [15] ，本实验依据噬菌体分离地点重庆医科大学和标本号，命名为 Chy2。

　1.1.3 溶原性鉴定

　 参照文献[13]的方法，略有改动，随机选取10个噬菌斑，分别以无菌接种环在噬菌斑中心接触1下，划线接种于7H9固体培养基，37 ℃培养3 d后可见部分平板长出单个菌落，用接种环挑取单个菌落接种于7H9液体培养基中，调整菌浓度为1.5×10 8

　CFU/mL。取5 ml菌悬液加入平皿中，置于距紫外灯管(15 W)30 cm处的磁力搅拌器上搅拌并照射，在照射30 s和60 s后，分别取出2 ml照射液，于37 ℃继续振荡培养过夜，离心取上清，适当稀释，以原始病原菌为指示菌铺双层琼脂平板，不加上清液的原始病原菌菌液为阴性对照，噬菌体液加原始病原菌为阳性对照，观察噬菌斑，如有噬菌斑出现即为溶原性菌株。重复实验3次。

　1.1.4 分支杆菌噬菌体电镜观察

　 采用双层琼脂平板培养法扩增噬菌体，参照文献 [14] 中 λ噬菌体颗粒提取方法，纯化噬菌体，调整噬菌体滴度至5×10 10 PFU/mL，负染后透射电镜(日立 H-7500)观察噬菌体Chy2、D29、TM4 形态。

　1.1.5 核酸提取及鉴定

　 取噬菌体纯化颗粒，采用 λ 噬菌体 DNA 提取试剂盒(北京艾比根公司)提取 DNA，定量后用限制性核酸内切酶EcoRⅠ、BamH I、BglⅡ(加拿大 Fermentas 公司)酶切噬菌体基因组，酶切反应体系置于 37 ℃过夜孵育后，酶切产物做琼脂糖凝胶电泳，经 Hind Ⅲ酶切的 λ 噬菌体 DNA(美国 NEB 公司)作为分子标记(Marker)，80 V 电压电泳，60 min 后停止电泳，观察拍照，根据酶切图谱分析噬菌体核酸类型和基因组大小以及比较新噬菌体与 D29、TM4 的差异。

　1.2 分支杆菌噬菌体 Chy2 最佳 MOI 感染复数(multiplicity of infection，MOI)是指初始感染时加入噬菌体的数量与宿主菌数量的比值。参照文献[16]的方法，略有改进，根据预实验测定噬菌体的滴度和麦氏比浊法测定的宿主菌(本实验为耻垢分支杆菌 mc 2 155)的浓度，按照不同的感染复数加入 Chy2 和宿主菌，铺双层平板 37 ℃过夜培养，各点均作 3 份复板培养。用平板菌落计数法测定所加入宿主菌的浓度，计算出确切感染复数。次日收集噬菌体，梯度稀释测定滴度，产生最高噬菌体滴度的 MOI 为最佳感染复数。

　1.3 分支杆菌噬菌体 Chy2 一步生长曲线 参照文献[13,16]的方法，略有改动，加入Chy2及耻垢分支杆菌mc 2 155使感染复数为0.1，37 ℃温育15 min后加入4％硫酸亚铁铵杀灭未吸附的噬菌体，13 000 ×g离心1 min，弃上清，7H9液体培养基洗涤2次后高倍稀释(100 000倍)，迅速置于37 ℃大振幅摇床中培养(160 转/min)，开始计时，根据预实验结果每30 min取样100 μl，13 000×g离心1 min，吸取上清测定噬菌体滴度，各时间点均作双份复管取平均值，实验重复3次。0 min时离心后的沉淀与耻垢分支杆菌mc 2 155混合后铺板，产生的噬菌斑数即为感染初期感染了噬菌体的宿主菌数。根据实测值(未乘稀释倍数)绘制一步生长曲线，得出Chy2的潜伏期、裂解期和裂解量。

　1.4 分支杆菌噬菌体 Chy2 宽噬实验 收集本科室结核菌室日常分离到的临床病原菌32株和结核分支杆菌标准株H 37 Rv，参考文献[17]采用单斑法测定噬菌体的宽噬谱，以耻垢分支杆菌mc 2 155为阳性对照，37 ℃培养，每天观察实验结果，出现噬菌斑者为阳性，即噬菌体能裂解该株菌，6周以后还未出现噬菌斑者判为阴性，即噬菌体不能裂解该株菌。

　1.5 分支杆菌噬菌体 Chy2 在不同 pH 值培养基中的裂解能力 将7H9固体培养基pH值调至5.0和7.4，取3.0×10 7 CFU耻垢分支杆菌mc 2 155与相同滴度(100 PFU/ml)的Chy2室温孵育15 min后与这两种培养基混合铺板，37 ℃培养过夜，观察Chy2在这两种培养基中的能否裂解宿主菌形成噬菌斑。

　2 结果 2.1 分支杆菌噬菌体噬菌斑和电镜观察 Chy2的噬菌斑圆形透明，直径约3 mm，呈现出烈性噬菌体的噬菌斑特征，D29和TM4的噬菌斑直径分别为5 mm和1 mm(见图1)。

　A

　 B

　C A、B、C分别为Chy2、D29、TM4的噬菌斑 图1 不同噬菌体感染耻垢分支杆菌mc 2 155所形成的噬菌斑形态 分别选取 10 个结构完整的噬菌体，用 DigitalMicrograph Demo3.4 软件测量其大小，Chy2 头部呈椭圆形，纵径为(62.4 ±

　1.7) nm，横径为(55.4±2.0)nm，长尾，可弯曲，不可收缩，尾长为(207.1 ± 20.0)nm，可见尾板和尾丝，依据国际病毒分类委员会 2005 年颁布的分类标准 [15] ，Chy2 属长尾噬菌体科(Siphoviridae)。D29 头部呈多面立体对称，头部直径为(59 ±1.3)nm，尾长为(129 ± 16.0)nm，TM4 头部也呈多面立体对称，直径为(51± 1.4)nm，尾长为(177 ± 11)nm（图 2）。

　 A

　 B

　C A、B、C分别为Chy2、D29、TM4，箭头所指为噬菌体。

　图2 不同噬菌体电镜照片(×100 000) 2.2 噬菌体溶原性鉴定 紫外线诱导法处理后宿主菌均不能形成噬菌斑，未发现Chy2为溶原性噬菌体的证据，结合图1所示噬斑清晰透明的特征，说明Chy2很可能为裂解性噬菌体。

　2.3 噬菌体酶切图谱 Chy2、D29、TM4 基因组核酸被限制性内切酶 EcoRⅠ、BamH I、BglⅡ酶切后，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后的结果如图 3 所示，泳道 1、14 为经 Hind Ⅲ酶切的 λ 噬菌体 DNA，作为电泳的 DNA 分子标记(DNA Marker)。从泳道 2、3、4 可见，Chy2 基因组能够被 EcoRⅠ、BamH I、BglⅡ酶切，这 3种酶能够识别双链 DNA 分子特定的核苷酸序列并切割双链DNA 分子的核酸内切酶，表明 Chy2 基因组为双链 DNA，D29、TM4 基因组经 EcoRⅠ、BamHⅠ酶切后的电泳图谱与 Chy2 有明显差别，但 TM4 经 BglⅡ酶切后与 Chy2 具有相似的 3 个片段。分析酶切图谱表明 Chy2 基因组大小为 49 kb 左右，D29、TM4 基因组大小分别为 47 kb 和 45 kb 左右（图 3）。

　 1、14: λ噬菌体DNA / Hind Ⅲ; 2: Chy2 DNA / EcoR I; 3: Chy2 DNA / BamH I; 4: Chy2 DNA /BglⅡ; 5: Chy2 基因组; 6: D29 DNA / EcoR I; 7: D29 DNA / BamH I; 8: D29 DNA / BglⅡ; 9: D29 基因组; 10: TM4 DNA / EcoR I; 11: TM4 DNA / BamH I; 12: TM4 DNA/ BglⅡ; 13: TM4 基因组. 图3 噬菌体基因组酶切电泳图 2.4 噬菌体 Chy2 最佳 MOI 噬菌体滴度结果见表 1。当 MOI 为 9.58×10 -5 时，Chy2感染耻垢分支杆菌 mc 2 155 后产生的子代噬菌体滴度在 8 个感染复数中最高，即最佳感染复数为 9.58×10 -5 ，最高滴度为(7.2×10 10 ±3.6×10 9 )

　PFU/ml，后续实验大量扩增 Chy2 时，可根据最佳感染复数扩增，以达到最大产量。

　表 1 噬菌体 Chy2 感染复数的测定 管号 细菌数(CFU) 噬菌体数(PFU) 感染复数(MOI) 滴度(24h)(PFU/ml) 1 4.3×10 7

　4.12×10 9

　95.8 1.5×10 9 ±1.2×10 8

　2 4.3×10 7

　4.12×10 8

　9.58 2.1×10 9 ±1.7×10 8

　3 4.3×10 7

　4.12×10 7

　9.58×10 -1

　3.2×10 9 ±1.0×10 8

　4 4.3×10 7

　4.12×10 6

　9.58×10 -2

　6.0×10 9 ±2.3×10 8

　5 4.3×10 7

　4.12×10 5

　9.58×10 -3

　6.0×10 9 ±1.5×10 8

　6 4.3×10 7

　4.12×10 4

　9.58×10 -4

　2.4×10 10 ±1.8×10 9

　7 4.3×10 7

　4.12×10 3

　9.58×10 -5

　7.2×10 10 ±3.6×10 9

　8 4.3×10 7

　4.12×10 2

　9.58×10 -6

　3.3×10 10 ±2.6×10 9

　9 4.3×10 7

　4.12×10 1

　9.58×10 -7

　2.6×10 9 ±0.9×10 8

　 2.5 噬菌体 Chy2 一步生长曲线 以离心后实际测得上清液中噬菌体的滴度为纵坐标，感染时间为横坐标，绘制一步生长曲线，如图4。0 min时离心后的沉淀与耻垢分支杆菌mc 2 155混合后铺板，产生的噬菌斑数为12，即为感染初期感染了噬菌体的宿主菌数。根据该曲线，可以看出Chy2感染宿主菌的潜伏时间约为210 min，裂解期为210~270 min。270 min 后进入平台期，噬菌体滴度不再增加。根据裂解量计算公式：裂解量=裂解末期噬菌体数÷感染初期宿主菌数，计算如下：280/12≈23，即Chy2感染宿主菌的裂解量为23。

　0501001502002503003500 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330培养时间( t / min)噬菌体Chy2数量(PFU) 图 4 噬菌体 Chy2 一步生长曲线

　2.6 噬菌体 Chy2 宽噬实验 经菌种鉴定，32 株临床分离株中有 28 株结核分支杆菌(结核菌)，2 株牛结核分支杆菌，2 株非结核分支杆菌，药敏结果见表 2。Chy2 的宽噬谱广，能裂解耻垢分支杆菌 mc 2 155、结核菌标准株 H 37 Rv 和多数临床分离菌株(见表 2)。Chy2 不仅能裂解大部分敏感结核菌(Sensitive tuberculuosis)，还能裂解耐药结核菌，对广泛耐多药结核菌(Extensively drug-resistant tuberculosis, XDR)裂解率达到 71.4％，对耐药牛结核分支杆菌(Drug-resistant bovine tuberculosis)裂解率达到 100.0％，除此之外， Chy2 还能裂解耐药非结核分 支杆菌 (drug-resistant non-tuberculous mycobacteria)。

　表 2 Chy2 对临床分离株的宿主谱

　临床分离株(32) 药敏实验 细菌株数 裂解株数 裂解率 结核分支杆菌 敏感 5 4 80.0% 耐药 23 13 56.5%

　MDR 7 3 42.9% XDR 7 5 71.4% 牛结核分支杆菌 耐药 2 2 100.0%

　MDR 1 1 100.0% 非结核分支杆菌 耐药 2 1 50.0% 注：MDR 为耐多药菌，XDR 为广泛耐多药菌 2.7 分支杆菌噬菌体 Chy2 在不同 pH 值的培养基中的裂解能力

　当 7H9 固体培养基 pH 值为 5.0 和 7.4 时，Chy2 均能裂解耻垢分支杆菌 mc 2 155(图 5)。巨噬细胞溶酶体内的 pH 值为5.0，人血液 pH 值为 7.35-7.45，即 Chy2 在这两者的 pH 环境下均能裂解宿主菌。

　A

　 B A：Chy2 在 pH 5.0 的固体培养基中裂解耻垢分支杆菌 mc2 155 形成噬菌斑; B为 Chy2 在 pH7.4 的固体培养基中裂解耻垢分支杆菌 mc2 155 形成噬菌斑

　图 5 Chy2 在不同 pH 值的培养基中的裂解能力

　3 讨论

　目前中国结核病疫情严峻，卫生部公布了全国第五次结核病流行病学抽样调查结果 [18] ：我国结核病年发病人数约为 130 万，占全球发病的 14.3%，位居全球第 2 位；15 岁及以上人群肺结核的患病率为459/10 万，其中传染性肺结核患病率为 66/10 万，耐多药率更高达 6.8%。相较于耐药和耐多药结核带来的严重威胁，抗结核药物研发严重滞后，感染广泛耐多药结核菌的病人面临无药可医的危险境地，急需研发新型抗结核药物。分支杆菌噬菌体有希望作为新型抗结核药物的开发对象。D29 是最早发现的分支杆菌噬菌体之一，由 Froman S 于 1954 年分离 [19] ，经过 60多年的研究，是目前研究最详尽的噬菌体，国内已有多篇文献报道利用 D29 治疗结核病 [9-11] ，均观察到D29 具有抗结核潜力，但是 D29 已被国外研究者注册专利 [20] ，而 TM4 由本课题组从美国匹兹堡大学 Hutful实验室引进，研究成果需与该实验室共享，所以要进一步研究噬菌体疗法必须寻找新的具有自主知识产权的噬菌体。本研究在国内首次分离出 1 株分支杆菌噬菌体 Chy2，其噬菌斑大小为 3mm，与 D29 和 TM4的噬菌斑形态有差异，电镜观察发现 Chy2 头部为椭圆形，不同于长尾噬菌体常见的多面立体对称形态，其尾部较 D29 和 TM4 长，酶切分析发现 Chy2、D29和 TM4 经 EcoRⅠ、BamH I 酶切后的电泳图谱有明显差别，通过噬菌斑形态，噬菌体电镜观察和酶切分析比较表明 Chy2 是不同于 D29 和 TM4 的新分支杆菌噬菌体，但 Chy2 经 BglⅡ酶切后与 TM4 具有相似的 3 个片段，说明这 2 个噬菌体具有一定程度的相似性。D29 和 TM4 经基因组测序发现基因组大小分别为 49136kb 和 52797kb [2] ，与分析酶切图谱得出的基因组大小有差别，经琼脂糖电泳只能初步估计 Chy2基因组大小，要准确获得基因组大小还需经基因组测序研究。

　Chy2 噬菌斑清晰透明，紫外线诱导法处理后的宿主菌均不能形成噬菌斑，未发现 Chy2 为溶原性噬菌体的证据，说明 Chy2 很可能为裂解性噬菌体，但要确认 Chy2 为裂解性噬菌体还需进行基因组学研究，本实验提取 Chy2 基因组 DNA，内切酶酶切分析发现 Chy2 基因组为双链 DNA 分子，下一步拟行基因组测序研究。

　噬菌体一步生长实验前提是确保每 1 个宿主菌吸附 1 个噬菌体，所以本实验选择感染复数为 0.1。由于是低复数感染，每条细菌只能被1个噬菌体感染，而未吸附噬菌体的宿主菌经过高倍稀释，可以避免二次吸附和感染，因而不会影响到后续各时间点噬菌体滴度的测定。有实验选择的 MOI 为 10 [16] ，这样可以保证每条宿主菌都感染噬菌体，却有可能出现 1 条宿主菌感染多个噬菌体的情况。Chy2 一步生长周期为270min，而多数快生长菌如大肠杆菌、铜绿假单胞菌对应的噬菌体一步生长周期小于 90min [13,16,21] 。耻垢分支杆菌虽为快生长分支杆菌，但相较于铜绿假单胞菌、大肠杆菌来说，它增殖的速度非常慢，这可能导致分支杆菌噬菌体潜伏期和裂解期长。

　噬菌体宿主识别的特异性在为微生物的鉴定和分型等方面做出贡献的同时，也给利用噬菌体进行抗菌治疗带来了困难，多价噬菌体的发现打破了特异性的束缚，为噬菌体疗法的临床应用奠定了基础。Chy2不仅能裂解耻垢分支杆菌mc 2 155、结核分支杆菌标准株H 37 Rv，还能裂解多数耐药结核菌，这为治疗耐药结核菌提供了新治疗手段。Chy2能裂解耻垢分支杆菌，是用于抗结核治疗的重要条件。结核菌生长缓慢，如果用结核菌扩增Chy2，不仅耗费大量时间，产量也受到限制，耻垢分支杆菌为快生长分支杆菌，24小时内即可得到超过10 12 PFU的噬菌体(100 ml)，为噬菌体疗法提供大量的噬菌体。结核菌专性噬菌体如DS6A，培养结核菌加上扩增噬菌体，则需要1个月以上，而采用最佳MOI扩增D29，24小时得到的最高产量比Chy2低10倍，难以大量扩增是D29用于噬菌体疗法的障碍。此外，非结核分支杆菌耐药率高，难治疗，预后差，Chy2能裂解耐药的非结核分支杆菌，这为非结核分支杆菌病的治疗提供了新的思路。

　人体血液的 pH 值在 7.35-7.45 之间，Chy2 在 pH 7.4 时，生长状态好，说明 Chy2 在血液的 pH 值环境内能很好的侵染宿主菌。结核菌为胞内寄生菌，潜伏在巨噬细胞溶酶体内，导致结核病治疗时间长和结核病复发，溶酶体内 pH 值为 5.0 左右，Chy2 在 pH5.0时能侵染宿主菌形成噬菌斑，说明这株噬菌体在酸性环境下能裂解宿主菌。噬菌体 D29 在 pH 值为 5.0 的培养基中能形成噬菌斑(见待发表的结果)，彭丽等的研究发现 D29 能裂解巨噬细胞内的结核菌 [5] ，而 TM4在 pH 为 5.0 的培养基中不能形成噬菌斑(见待发表的结果)，Danelishvili L 等研究发现 TM4 不能裂解巨噬细胞内的结核菌，需利用耻垢分支杆菌作为载体才能裂解 [6] ，故推测 Chy2 具有裂解巨噬细胞内结核菌的潜力。

　4. 参考文献

　[1] O"Flaherty S, Ross RP, Coffey A. Bacteriophage and their lysins for

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　邓强庭）