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    实验报告等电点聚焦测蛋白质等电点

    时间：2020-09-26 11:55:14 来源：蒲公英阅读网 本文已影响人 蒲公英阅读网手机站

    相关热词搜索：蛋白质 聚焦 实验

    　1 / 4

    　等电点聚焦测蛋白质等电点 1. 了解蛋白质的两性解离性质和等电点聚焦的原理； 2. 学习测定蛋白质等电点的方法并掌握圆盘电泳技术。

    　二. 实验原理 等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，IEF 实质 就是在稳定的 pH 梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。

    　在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的 结果，在两极之间逐步建立起稳定的 pH 梯度，当蛋白质分子或其它两性分子存 在于这样的 pH 梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最 终到达一个使其表面静电荷为 0 的区带，这时的 pH 则是这种分子的 pl。聚焦在 等电点的分子也会不断地扩散。一旦偏离其等电点后，由于 pH 环境的改变，分 子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向 pl 迁移。因此，这些分子总是处于不 断地扩散和抗扩散的平衡之中，在 pl 处得以“聚焦”。

    　三. 实验步骤 1. 凝胶制备 按表 1 的比例配制 4ml 工作胶液，在真空干燥器中抽气 10min。每组 4 管，每管 加胶液 1.8ml。混匀后立即注入到已准备好的凝胶管中，胶液加至离管顶部 1cm 处，在胶面上再覆盖 3mm 厚的水层，应注意不要让水破坏胶的表面，室温下放置 20〜30min 即可聚合。

    　表 1 凝胶工作液配比 凝胶母液（丙烯酰胺 30%甲叉双丙烯 酰胺 0.8%）

    　1ml 10%±硫酸铵 0.02ml 水 2.68ml 载体两性电解液 0.15ml 蛋白样品液 0.1ml,0.05ml TEMED 0.02ml 2. 电泳 吸去凝胶柱表面上的水层，将凝胶管垂直固定于圆盘电泳槽中。于电泳槽下槽加 入0.2 %的 500ml 硫酸作正极；上槽加入 0.5 %的 800ml 乙醇胺作负极打开电源，

    　2 / 4

    　将电压恒定为 300V,因为聚焦过程是电阻不断加大的过程，故聚焦电泳过程中， 电流将不断下降，降至稳定时，即表明聚焦已完成，继续电泳约 30min 后，停止 电泳，全程约需 3h。

    　3. 剥胶 电泳结束后，取下凝胶管，用水洗去胶管两端的电极液，按照柱状电泳剥胶的方 法取出胶条，以胶条的正极为“头”，负极为“尾”，正极端呈酸性，负极端呈碱 性。剥离后，量出并记录凝胶的长度。

    　4. 固定 取其中的凝胶条 3 根置于一个小培养皿内，倒入 10%放在三氯乙酸固定液中固定， 约半小时后，即可看到胶条内蛋白质的白色沉淀带。

    　固定完毕，倒出固定液用直 尺量出胶条长度 L i 和正极端到蛋白质白色沉淀带中心，即聚焦部位的长度 L 2 o 5. pH 梯度的测量 切段法：将未经固定的 1 根胶条，按照从正极端 （ 酸性端）到负极端（碱性端）的顺 序切成相等的 10 段，按次放人有标号的、装有 0.0IM 氯化钾的试管中，浸泡过 夜。然后用 pH 计测出每管浸泡液的 pH 并记录。

    　四•实验结果 1.凝胶条的长度及染色蛋白带的位置 凝胶条编号 1 2 3 4 固定前的长度 7.8cm 7.8cm 7.4cm 7.7cm L o

    　 固定后的长度 7.7cm 7.8cm 7.4cm 未染色，测 pH L 1

    　梯度 蛋白带距酸端 1.3cm 1.4cm 1.3cm

    　距离 L 2

    　 蛋白质距正极 1.32cm 1.4cm 1.3cm

    　实际长度 L S

    　 2.pH 梯度表及其相应标准曲线 标号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 长度 /cm 0.77 0.77 0.77 0.77 0.77 0.77 0.77 0.77 0.77 0.77 pH 值 3.05 3.72 5.04 6.76 7.24 7.99 8.62 9.58 10.1 4 10.1 8

    　3 / 4

    　蛋白质样品等电点的计算：

    　蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度 =固定后的蛋白区带中心距凝胶条正 极端的距离*固定前凝胶条长度/固定后凝胶条长度 则将上述数据代入 L F L 2 *

    　- L O ，求出蛋白质距正极实际长度 L s 分别为 1.3cm、1.4cm、 L I

    　1.3cm o 由凝胶条 1、2 和 3 及其相应蛋白带距离可计算出蛋白带距酸端的平均距 离：(1.3+1.4+1.32)/3=1.34 ②计算出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度后，直接从 pH 梯度曲线上 求出该蛋白质等电点。

    　得出其标准公式为：y = 0.8372X + 2.6273 则待测蛋白质的等电点为 0.8372*1.34+2.6273=3.75 五•实验分析及讨论 (1) 实验结果测得的样品蛋白的等电点为 3.75，通过查常见蛋白质等电点参 考值表格可知，其为 B -卵黄脂磷蛋白。由于记录凝胶长度及蛋白质距正极的距 离存在读数误差，所以也可能是伴花生球蛋白(3.7-5.0 )o (2)

    　等电点聚焦测蛋白质等电点分辨率高，可将等电点相差 0.01 — 0.02pH 单位 的蛋白质分开。不像一般电泳易受扩散作用影响， 使区带越走越宽；聚焦电泳则 能抵消扩散作用，使区带越走越窄。同时，很稀的样品也可以聚焦而浓缩，实验 操作起来也简单方便。

    　(3) 其存在其不足之处是在实验操作过程当中，读数的取值、样品溶液是否含 盐、在等电点时蛋白质是否溶解或变性， 都会影响实验结果。因为盐会增大电流 量，产生热量；盐分子移至两极时，将产生酸或碱，中和两性电解质。由于这些 影响因素的存在，个人认为利用这一种方法还不足以鉴定出蛋白质种类。

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    　附 常见蛋白质等电点参考值

    　第电点 实 m 质 SFfe<

    　12 J

    　XS 神召 W 兰[izhLpriDO 12.1 血 虹星自百人）[L BEOO

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