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    elisa酶联免疫吸附实验报告

    时间：2020-10-23 12:09:30 来源：蒲公英阅读网 本文已影响人 蒲公英阅读网手机站

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    　e ｌis ａ酶联免疫吸附实验报告

    　得目验实.一ﻫﻫ酶联免疫吸附测定(enzyme—linｋed immunｏsorbeｎt assay 简称 EＬISA)就是在免疫酶技术(iｍmunoenzymatiｃ ｔechniｑuｅs)得基础上发展起来得一种新型得免疫测定技术，ＥLＩＳA过程包括抗原(抗体)吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原)， 再加相应酶标记抗体(抗原）,生成抗原（抗体)-－待测抗体(抗原）-－酶标记抗体得复合物,再与该酶得底物反应生成有色产物。借助分光光度计得光吸收计算抗体（抗原）得量。待测抗体(抗原)得定量与有色产生成正比。

    　 理原验实.二ﻫ用于免疫酶技术得酶有很多，如过氧化物酶,碱性磷酸酯酶,β－D－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶,6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于ＥＬIＳA 法得酶有辣根过氧化物酶,碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化得就是氧化还原反应,在呈色后须立刻测定,否则空气中得氧化作用使颜色加深,无法准确地定量. 辣根过氧化物酶（HＲP）就是一种糖蛋白,每个分子含有一个氯化血红素（protoｎｈeｍiｎ）区作辅基。酶得浓度与纯度常以辅基得含量表示。氯化血红素辅基得最大吸收峰就是 40３ｎm，HRP 酶蛋白得最大吸收峰就是 27５nm，所以酶得浓度与纯度计算式就是（已知 HＲP 得 A（１cm 4０3nm 1%)＝２5，式中 1%

    　指ＨRP 百分浓度为 100mｌ含酶蛋白 1g，即 10mg/ｍｌ,所以,酶浓度以 mg/mｌ 计算就是ＨRP 得 A(１cm 403ｎm mｇ／ｍl=2、5)ＨRP 纯度（ＲＺ)=A403nm／A275nm 纯度 RZ（Reiｎheｉt Ｚahl）值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度 HRＰ得 RＺ值在３、0 左右,最高可达 3、4.用于ＥLISA 检测得 HRP 得 RZ 值要求在３、０以上.):条三有理原本基得 ASILＥﻫﻫ1（就能可，面表体载相固于附吸地性理物以能体抗或原抗ﻫ是蛋白与聚苯乙烯表面间得疏水性部分相互吸附,并保持其免疫学活性; (2)抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物,而此种酶结合物仍能保持其免疫学与酶学活性;)3(酶ﻫ结合物与相应抗原或抗体结合后,可根据加入底物得颜色反应来判定就是否有免疫反应得存在,而且颜色反应得深浅就是与标本中相应抗原或抗体得量成正比例得,因此,可以按底物显色得程度显示试验结果。

    　ELＩSA 法就是免疫诊断中得一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起得传染病、寄生虫病及非传染病等方面得免疫诊断。也已应用于大分子抗原与小分子抗原得定量测定,根据已经使用得结果，认为 ELISA 法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点.不仅适用于临床标本得检查,而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体,而且也可用于测定体液中得循环抗原，所以也就是一种早期诊断得良好方法。因此 EＬＩSＡ法在生物医学各领域得应用范围日益扩大,可概括四个方面：

    　1、免疫酶染色各种细胞内成份得定位。

    　2、研究抗酶抗体得合成。

    　3、显现微量得免疫沉淀反应。

    　4、定量检测体液中抗原或抗体成份。

    　ﻫ

    　基本方法一 用于检测未知抗原得双抗体夹心法: 、1

    　液冲缓被包盐酸碳牰、9HP Ｍ５0、0 用：被包ﻫ将抗体稀释至蛋白质含量为１~10μg/ｍl。在每个聚苯乙烯板得反应孔中加 0、1ｍl，4℃过夜。次日,弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗３次，每次 3 分钟。（简称洗涤,下同)。

    　 2、 加样:加一定稀释得待检样品０、1ml 于上述已包被之反应孔中,置３７℃孵育１小时.然后洗涤。(同时做空白孔,阴性对照孔及阳性对照孔）． 、３

    　体抗标酶得释稀鲜新入加,中孔应反各于:体抗标酶加ﻫ（经滴定后得稀释度）0、1ml。37℃孵育 0、5～1 小时，洗涤。

    　 ４、 加底物液显色:于各反应孔中加入临时配制得 TMB 底物溶液 0、1mｌ,37℃１0～３0 分钟。

    　、5

    　ﻫ终止反应:于各反应孔中加入 2Ｍ硫酸 0、０5ml。

    　 6、 结果判定:可于白色背景上,直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色得深浅,以“＋”、“—”号表示。也可测 O•D 值:在 ELISA 检测仪上,于４５0nm（若以 ABTS 显色，则 410nｍ)处,以空白对照孔调零后测各孔 O•D 值，若大于规定得阴性对照 OD 值得２、1 倍，即为阳性。

    　ﻫ基本方法二 用于检测未知抗体得间接法:、0 加孔每 ，ｌm／ｇμ０１～1 至释稀原抗知已将液冲缓被包用ﻫ１mｌ，4℃过夜。次日洗涤３次. ↓做时同(。涤洗，时小 1 育孵℃７3 置,中孔应反之被包已述上于 lm1、0)体抗知未(品样检待得释稀定一加ﻫ

    　空白、阴性及阳性孔对照）

    　↓ﻫ于反应孔中，加入新鲜稀释得酶标第二抗体（抗抗体)０、1mｌ,37℃孵育 30—60 分钟,洗涤,最后一遍用 DDW洗涤。

    　↓ﻫ其余步骤同“双抗体夹心法”得 4、５、６。( 物底与酶 ）二ﻫﻫ酶结合物就是酶与抗体或抗原, 半抗原在交联剂作用下联结得产物。就是 ELIＳＡ成败得关键试剂,它不仅具有抗体抗原特异得免疫反应,还具有酶促反应,显示出生物放大作用,但不同得酶选用不同得底物．技疫免ﻫ术常用得酶及其底物

    　酶 底物 显色反应 测定波长 *２94 色红橘 胺二苯邻 酶物化氧过根辣ﻫ四甲替联苯胺 黄色 ４６0＊* ９4４ 色棕 酸杨水基氨ﻫ邻联苯甲胺 兰色 425 2，2＇—连胺基—２(３-乙基-并噻唑啉磺酸—6）铵盐 蓝绿色 64２Ｐ（盐酸磷酚基硝－4 酶酯酸磷性碱ﻫNＰ) 黄色 400 萘酚—AＳ—Mx 磷酸盐+重氮盐 红色 5００+糖萄葡ﻫ024,504 色黄 糖萄葡+ＰRH+STBＡ 酶化氧糖萄葡ﻫ甲硫酚嗪+噻唑兰 深蓝色 0５４，06３ 光荧 )ＧｕM4（苷糖乳半基酮伞基甲 酶苷糖乳半-Ｄ—βﻫ

    　硝基酚半乳糖苷(ONＰG) 黄色 420

    　ﻫ＊ 终止剂为 2mｏl/L H2ＳＯ４ ** 。剂止终得同不有物底得同不 ,酸檬柠 L/loｍ 2 为剂止终ﻫ可催化下列反应：

    　ＨRＰ+Ｈ2O2→复合物 复合物+ＡH２→过氧化物酶+H2Ｏ+Ａ AH2 -—为无色底物, 供氢体; A—— 为有色产物。(ﻫ 法方种四得用常ＡSILE )三ﻫﻫ1．直接法测定抗原 ；面表体载在附吸原抗将ﻫ加酶标抗体,形成抗原—抗体复合物; 。量原抗＝量解降得物底.物底加ﻫ 2。间接法测定抗体 ；面表体载相固于附吸原抗将ﻫ加抗体， 形成抗原-抗体复合物； 加酶标抗体;ﻫ 。量体抗=量解降得物底定测 .物底加ﻫ3。双抗体夹心法测定抗原合复体抗-原抗成形,原抗加ﻫ;面表相固于附吸体抗得得获物动种一第疫免原抗将ﻫ物; ;物合复体抗原抗体抗成形,体抗得得获物动种二第疫免原抗加ﻫ加酶标抗抗体(第二种动物抗体得抗体）; 。量原抗=量解降得物底。物底加ﻫ 、4 ;面表体载相固在附吸体抗将ﻫ原抗定测法争竞ﻫ)1(）;原抗标酶入加ﻫ３（,)2(抗测待与原抗标酶入加ﻫ

    　原;ﻫ 。量原抗知未=差得量解降物底孔品样与孔照对。物底加ﻫ三。仪器与材料 ﻫ1、 聚苯乙烯微量细胞培养板（平板， 40, 9６孔). 、2 仪测检疫免联酶ﻫ、3兔抗羊酶物化氧过根辣ﻫIｇＧ， 工作稀释度 1:１０00。

    　4、 包被液::0、05mol／L pH９、6 碳酸缓冲液，4℃，保存, Ｎa２CO3 0、１5 克， ＮａHＣO3 0、２93克,蒸馏水稀释至 100 ml。

    　5、 稀释液:０、0１ｍｏl／ＬpH7、4 PＢS--Tween-－20， 4℃，保存、 NaCｌ 8g， ＫＨ2PO4 0、2ｇ， Ｎa2HPO4、1２H2O 2、９g， Twｅen—２0,0、５mｌ、 蒸馏水加至 1000ｍｌ。

    　、6同:液涤洗ﻫ稀释液 7、 封闭液:０、５%鸡卵清蛋白,pH7、4 PBS。

    　8、 邻苯二胺溶液（底物):临用前配制 ０、1Ｍ 柠檬酸（2、1ｇ／100ml), ６、1ml 0、２M Na2HＰＯ４、１２H2O (7、163g／１00ml) 6、4mｌ, 蒸馏水 12、５ml, 邻苯二胺１0mg, 溶解后, 临用前加 30%H２O２ ４0 微升。

    　9、 终止液:2ｍol/ＬH2SO4。

    　骤步作操 、四ﻫﻫ1、 包被抗原:用包被液将抗原作适当稀释， 一般为 1～1０微克/孔，每孔加２00 微升，3７℃温育 1 小时

    　后，4℃冰箱放置１６～18 小时。

    　、2将后最,次三复反,钟分三放静，液涤洗满加，体液中孔板尽倒:涤洗ﻫ反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。

    　、3 .时小一置放℃73，升微 002 液闭封加ﻫ４、 洗涤同 2. 、5℃73．照对液释稀作时同。升微 002 孔每,，释稀种几作清血检被将液释稀用:清血检被加ﻫ放置 2 小时。

    　、６ 。2 同涤洗ﻫ、7。时小 1 ℃７３置放 ,升微 00２孔每 ，GgＩ兔抗羊酶物化氧过根辣加ﻫ 、８ .2 同涤洗ﻫ、9 。钟分 51－-01 处暗温室,ｌm0０2 加液溶胺二苯邻:物底加ﻫ10、 加终止液:每孔 50 微升。

    　、１1.数读 mn09４录记仪测检疫免联酶用：果结察观ﻫ

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