elisa酶联免疫吸附实验报告
e lis a酶联免疫吸附实验报告
得目验实.一ﻫﻫ酶联免疫吸附测定(enzyme—linked immunosorbent assay 简称 ELISA)就是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)得基础上发展起来得一种新型得免疫测定技术,ELISA过程包括抗原(抗体)吸附在固相载体上称为包被,加待测抗体(抗原), 再加相应酶标记抗体(抗原),生成抗原(抗体)--待测抗体(抗原)--酶标记抗体得复合物,再与该酶得底物反应生成有色产物。借助分光光度计得光吸收计算抗体(抗原)得量。待测抗体(抗原)得定量与有色产生成正比。
理原验实.二ﻫ用于免疫酶技术得酶有很多,如过氧化物酶,碱性磷酸酯酶,β-D-半乳糖苷酶,葡萄糖氧化酶,碳酸酐酶,乙酰胆碱酯酶,6-磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于ELISA 法得酶有辣根过氧化物酶,碱性磷酸酯酶等,其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化得就是氧化还原反应,在呈色后须立刻测定,否则空气中得氧化作用使颜色加深,无法准确地定量. 辣根过氧化物酶(HRP)就是一种糖蛋白,每个分子含有一个氯化血红素(protonhemin)区作辅基。酶得浓度与纯度常以辅基得含量表示。氯化血红素辅基得最大吸收峰就是 403nm,HRP 酶蛋白得最大吸收峰就是 275nm,所以酶得浓度与纯度计算式就是(已知 HRP 得 A(1cm 403nm 1%)=25,式中 1%
指HRP 百分浓度为 100ml含酶蛋白 1g,即 10mg/ml,所以,酶浓度以 mg/ml 计算就是HRP 得 A(1cm 403nm mg/ml=2、5)HRP 纯度(RZ)=A403nm/A275nm 纯度 RZ(Reinheit Zahl)值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度 HRP得 RZ值在3、0 左右,最高可达 3、4.用于ELISA 检测得 HRP 得 RZ 值要求在3、0以上.):条三有理原本基得 ASILEﻫﻫ1(就能可,面表体载相固于附吸地性理物以能体抗或原抗ﻫ是蛋白与聚苯乙烯表面间得疏水性部分相互吸附,并保持其免疫学活性; (2)抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物,而此种酶结合物仍能保持其免疫学与酶学活性;)3(酶ﻫ结合物与相应抗原或抗体结合后,可根据加入底物得颜色反应来判定就是否有免疫反应得存在,而且颜色反应得深浅就是与标本中相应抗原或抗体得量成正比例得,因此,可以按底物显色得程度显示试验结果。
ELISA 法就是免疫诊断中得一项新技术,现已成功地应用于多种病原微生物所引起得传染病、寄生虫病及非传染病等方面得免疫诊断。也已应用于大分子抗原与小分子抗原得定量测定,根据已经使用得结果,认为 ELISA 法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点.不仅适用于临床标本得检查,而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此,也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体,而且也可用于测定体液中得循环抗原,所以也就是一种早期诊断得良好方法。因此 ELISA法在生物医学各领域得应用范围日益扩大,可概括四个方面:
1、免疫酶染色各种细胞内成份得定位。
2、研究抗酶抗体得合成。
3、显现微量得免疫沉淀反应。
4、定量检测体液中抗原或抗体成份。
ﻫ
基本方法一 用于检测未知抗原得双抗体夹心法: 、1
液冲缓被包盐酸碳牰、9HP M50、0 用:被包ﻫ将抗体稀释至蛋白质含量为1~10μg/ml。在每个聚苯乙烯板得反应孔中加 0、1ml,4℃过夜。次日,弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗3次,每次 3 分钟。(简称洗涤,下同)。
2、 加样:加一定稀释得待检样品0、1ml 于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时.然后洗涤。(同时做空白孔,阴性对照孔及阳性对照孔). 、3
体抗标酶得释稀鲜新入加,中孔应反各于:体抗标酶加ﻫ(经滴定后得稀释度)0、1ml。37℃孵育 0、5~1 小时,洗涤。
4、 加底物液显色:于各反应孔中加入临时配制得 TMB 底物溶液 0、1ml,37℃10~30 分钟。
、5
ﻫ终止反应:于各反应孔中加入 2M硫酸 0、05ml。
6、 结果判定:可于白色背景上,直接用肉眼观察结果:反应孔内颜色越深,阳性程度越强,阴性反应为无色或极浅,依据所呈颜色得深浅,以“+”、“—”号表示。也可测 O•D 值:在 ELISA 检测仪上,于450nm(若以 ABTS 显色,则 410nm)处,以空白对照孔调零后测各孔 O•D 值,若大于规定得阴性对照 OD 值得2、1 倍,即为阳性。
ﻫ基本方法二 用于检测未知抗体得间接法:、0 加孔每 ,lm/gμ01~1 至释稀原抗知已将液冲缓被包用ﻫ1ml,4℃过夜。次日洗涤3次. ↓做时同(。涤洗,时小 1 育孵℃73 置,中孔应反之被包已述上于 lm1、0)体抗知未(品样检待得释稀定一加ﻫ
空白、阴性及阳性孔对照)
↓ﻫ于反应孔中,加入新鲜稀释得酶标第二抗体(抗抗体)0、1ml,37℃孵育 30—60 分钟,洗涤,最后一遍用 DDW洗涤。
↓ﻫ其余步骤同“双抗体夹心法”得 4、5、6。( 物底与酶 )二ﻫﻫ酶结合物就是酶与抗体或抗原, 半抗原在交联剂作用下联结得产物。就是 ELISA成败得关键试剂,它不仅具有抗体抗原特异得免疫反应,还具有酶促反应,显示出生物放大作用,但不同得酶选用不同得底物.技疫免ﻫ术常用得酶及其底物
酶 底物 显色反应 测定波长 *294 色红橘 胺二苯邻 酶物化氧过根辣ﻫ四甲替联苯胺 黄色 460** 944 色棕 酸杨水基氨ﻫ邻联苯甲胺 兰色 425 2,2'—连胺基—2(3-乙基-并噻唑啉磺酸—6)铵盐 蓝绿色 642P(盐酸磷酚基硝-4 酶酯酸磷性碱ﻫNP) 黄色 400 萘酚—AS—Mx 磷酸盐+重氮盐 红色 500+糖萄葡ﻫ024,504 色黄 糖萄葡+PRH+STBA 酶化氧糖萄葡ﻫ甲硫酚嗪+噻唑兰 深蓝色 054,063 光荧 )GuM4(苷糖乳半基酮伞基甲 酶苷糖乳半-D—βﻫ
硝基酚半乳糖苷(ONPG) 黄色 420
ﻫ* 终止剂为 2mol/L H2SO4 ** 。剂止终得同不有物底得同不 ,酸檬柠 L/lom 2 为剂止终ﻫ可催化下列反应:
HRP+H2O2→复合物 复合物+AH2→过氧化物酶+H2O+A AH2 -—为无色底物, 供氢体; A—— 为有色产物。(ﻫ 法方种四得用常ASILE )三ﻫﻫ1.直接法测定抗原 ;面表体载在附吸原抗将ﻫ加酶标抗体,形成抗原—抗体复合物; 。量原抗=量解降得物底.物底加ﻫ 2。间接法测定抗体 ;面表体载相固于附吸原抗将ﻫ加抗体, 形成抗原-抗体复合物; 加酶标抗体;ﻫ 。量体抗=量解降得物底定测 .物底加ﻫ3。双抗体夹心法测定抗原合复体抗-原抗成形,原抗加ﻫ;面表相固于附吸体抗得得获物动种一第疫免原抗将ﻫ物; ;物合复体抗原抗体抗成形,体抗得得获物动种二第疫免原抗加ﻫ加酶标抗抗体(第二种动物抗体得抗体); 。量原抗=量解降得物底。物底加ﻫ 、4 ;面表体载相固在附吸体抗将ﻫ原抗定测法争竞ﻫ)1();原抗标酶入加ﻫ3(,)2(抗测待与原抗标酶入加ﻫ
原;ﻫ 。量原抗知未=差得量解降物底孔品样与孔照对。物底加ﻫ三。仪器与材料 ﻫ1、 聚苯乙烯微量细胞培养板(平板, 40, 96孔). 、2 仪测检疫免联酶ﻫ、3兔抗羊酶物化氧过根辣ﻫIgG, 工作稀释度 1:1000。
4、 包被液::0、05mol/L pH9、6 碳酸缓冲液,4℃,保存, Na2CO3 0、15 克, NaHCO3 0、293克,蒸馏水稀释至 100 ml。
5、 稀释液:0、01mol/LpH7、4 PBS--Tween--20, 4℃,保存、 NaCl 8g, KH2PO4 0、2g, Na2HPO4、12H2O 2、9g, Tween—20,0、5ml、 蒸馏水加至 1000ml。
、6同:液涤洗ﻫ稀释液 7、 封闭液:0、5%鸡卵清蛋白,pH7、4 PBS。
8、 邻苯二胺溶液(底物):临用前配制 0、1M 柠檬酸(2、1g/100ml), 6、1ml 0、2M Na2HPO4、12H2O (7、163g/100ml) 6、4ml, 蒸馏水 12、5ml, 邻苯二胺10mg, 溶解后, 临用前加 30%H2O2 40 微升。
9、 终止液:2mol/LH2SO4。
骤步作操 、四ﻫﻫ1、 包被抗原:用包被液将抗原作适当稀释, 一般为 1~10微克/孔,每孔加200 微升,37℃温育 1 小时
后,4℃冰箱放置16~18 小时。
、2将后最,次三复反,钟分三放静,液涤洗满加,体液中孔板尽倒:涤洗ﻫ反应板倒置在吸水纸上,使孔中洗涤液流尽。
、3 .时小一置放℃73,升微 002 液闭封加ﻫ4、 洗涤同 2. 、5℃73.照对液释稀作时同。升微 002 孔每,,释稀种几作清血检被将液释稀用:清血检被加ﻫ放置 2 小时。
、6 。2 同涤洗ﻫ、7。时小 1 ℃73置放 ,升微 002孔每 ,GgI兔抗羊酶物化氧过根辣加ﻫ 、8 .2 同涤洗ﻫ、9 。钟分 51--01 处暗温室,lm002 加液溶胺二苯邻:物底加ﻫ10、 加终止液:每孔 50 微升。
、11.数读 mn094录记仪测检疫免联酶用:果结察观ﻫ
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